[學(xué)習(xí)]分子生物學(xué)研究策略-基因表達技術(shù)

1、分子生物學(xué)研究策略,3、基因分子生物學(xué)的基本技術(shù) 3.1 基因的分子雜交技術(shù) 3.2 基因的擴增技術(shù)（PCR） 3.3 基因的突變技術(shù)（轉(zhuǎn)座技術(shù)） 3.4 基因的表達技術(shù) （表達系統(tǒng)） 3.5 轉(zhuǎn)基因技術(shù) （轉(zhuǎn)基因動物、 轉(zhuǎn)基因植物） 3.6 微陣列分析,**基因表達系統(tǒng),1、大腸桿菌表達系統(tǒng)2、芽孢桿菌表達系統(tǒng)3、乳酸菌基因

2、表達系統(tǒng)4、鏈霉菌基因表達系統(tǒng)5、酵母菌表達系統(tǒng)6、絲狀真菌表達系統(tǒng)7、昆蟲表達系統(tǒng)8、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)9、植物生物反應(yīng)器,1、大腸桿菌表達系統(tǒng)（Gene Expression system in E.coli）,1）大腸桿菌表達系統(tǒng) 的特點：（1）遺傳背景清楚（2）目的基因表達水 平高（3）培養(yǎng)周期短（4）抗感染能力強,2）大腸桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢,完善現(xiàn)有的表達系統(tǒng)；重組蛋白質(zhì)的正

3、確折疊；構(gòu)象形成；蛋白質(zhì)的分泌；菌體表面表達技術(shù)及其應(yīng)用；重組蛋白質(zhì)修飾加工。,真核基因在不同表達系統(tǒng)的表達,表達白細胞介素IL-3(成熟蛋白) 大腸桿菌表達系統(tǒng) 20-30u 地衣芽孢桿菌表達系統(tǒng) 250-300u 酵母菌表達系統(tǒng) 20u 哺如動物細胞 2u,2、芽胞桿菌表達系統(tǒng)（Gene Expressio

4、n system in Bacillus）,1）特點枯草芽孢桿菌是非致病的土壤微生物，嚴格生長在有氧條件下。枯草芽孢桿菌遺傳學(xué)相當先進，很多噬菌體和質(zhì)粒適合用作克隆載體。芽孢桿菌可大量產(chǎn)生幾種商品酶，如?-淀粉酶，蛋白酶及蘇云金桿菌的殺蟲晶體蛋白等，發(fā)酵技術(shù)發(fā)達。具有單層細胞膜組成較簡單的細胞外殼。 易于分離純化分泌蛋白,2）枯草桿菌宿主菌株 由于大腸桿菌的CaCl2轉(zhuǎn)化法對枯草芽孢桿菌無效（1）選擇可轉(zhuǎn)化的菌株

5、 *168菌株及突變體： 營養(yǎng)要求、芽孢形成和萌發(fā)、蛋白酶缺失、重組缺陷、限制/修飾系統(tǒng)缺陷、轉(zhuǎn)座子插入（2）選擇轉(zhuǎn)化的方法感受態(tài)轉(zhuǎn)化：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：電轉(zhuǎn)化：甘氨酸添加培養(yǎng)感受態(tài)其它方法，如轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合轉(zhuǎn)移,3）、可作為宿主的其它菌種：嗜堿芽孢桿菌Bacillus abcalophilus 蛋白酶淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefacilus ?-淀粉酶短芽孢桿菌Bacil

6、lus brevis地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis 淀粉酶，抗真菌肽巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium 淀粉酶短小芽孢桿菌Bacillus pumilus 蛋白酶,球形芽孢桿菌Bacillus sphaericus 滅蚊毒素蛋白嗜熱芽孢桿菌Bacillus stearothermophilus 高溫?-淀粉酶蘇云金芽孢桿菌Bacillus thur

7、ingiensis 殺蟲晶體蛋白耐堿的芽孢桿菌Bacillus alcalophilic 堿性蛋白酶炭疽芽孢桿菌 Bacillus anthracis,4）枯草芽胞桿菌表達系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢,1、表達真核基因 蛋白酶水解——缺陷型、抑制劑 2、表達商業(yè)用酶 克隆基因的整合 3、表達殺蟲晶體蛋白 提高殺蟲毒力，減少殺蟲時間，增加廣譜 4、利

8、用芽孢桿菌基因工程技術(shù)擴大和加 強在醫(yī)藥領(lǐng)域多個方面的應(yīng)用,3、乳酸菌基因表達系統(tǒng)（Gene Expression system in Lactic Acid Bacteria）,1）特點：乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。大多數(shù)不運動，少數(shù)以周毛運動。菌體常排列成鏈。在其發(fā)酵產(chǎn)物中只有乳酸的稱為同型乳酸發(fā)酵，而產(chǎn)物中除乳酸外還有較多乙酸、乙醇、CO２等物質(zhì)的稱為異型乳

9、酸發(fā)酵。有微好氧菌和專性厭氧菌。,Lactic Acid Bacteria,Genera:StreptococcusLeuconostocPediococcusLactobacillusEnterococcusLactococcus,All the above genera growin chains.Many are used for the foodindustry.,2）理想乳酸菌表達載體的特征：1、穩(wěn)定的遺

10、傳、傳代能力（復(fù)制子）2、具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標記（Emr ）3、啟動子的轉(zhuǎn)錄是可以調(diào)控4、具有多克隆酶切位點,3）研究進展,（1）食品發(fā)酵方面的應(yīng)用,（2）乳酸菌菌種鑒定REA （Restriction Endonuclease Analysis）16S rRNA （PCR ）SDS-PAGE,（3）抗微生物和食品腐敗,（4）細胞表面層和外多糖利用生物異構(gòu)化方法從亞油酸生產(chǎn)具有生理活性的共軛亞油酸（CLA）異構(gòu)體單體。篩選

11、到一株產(chǎn)生9順,11反共軛亞油酸的乳桿菌L1，建立了亞油酸制備技術(shù)，CLA小試發(fā)酵工藝，共軛亞油酸的HPLC純化分離和毛細管電泳鑒定技術(shù)。,（5）蛋白質(zhì)降解、多肽降解和脂降解,（6）分子遺傳學(xué)基因克隆表達調(diào)控染色體分析,（7）益生菌（PROBIOTICS） Lactobacillus and Bifidobacterium,食品級基因修飾菌是指被導(dǎo)入源于同種或公認的安全的食品級微生物的基因，因此具有某種優(yōu)良性狀的用于發(fā)酵

12、食品生產(chǎn)的微生物。1、功能性基因必須源于同種菌或公認的安全的食品級微生物；2、載體必須是食品級的，不得含有非食品級的功能性DNA 片段；3、選擇性標記不得選用各種抗生素抗性標記。應(yīng)選用食品級的標記基因，如糖類利用標記、營養(yǎng)缺陷型標記等；4、宿主菌的遺傳特性清楚且穩(wěn)定，具有足夠的安全性，應(yīng)選用適當?shù)姆肿由飳W(xué)方法如DNA序列分析、雜交等確定宿主菌的遺傳組成。,食品級載體不但是GRAS微生物，而且不依靠抗生素抗性作為選擇標記，因而更

13、為安全，在食品、醫(yī)藥方面具有廣泛的應(yīng)用潛力。乳酸菌的食品級 高效誘導(dǎo)分泌表 達NICE系統(tǒng)是可 控制的蛋白質(zhì)生 產(chǎn)的最理想的系 統(tǒng)。,4、鏈霉菌基因表達系統(tǒng)（Gene Expression system in Streptomyces ）,1）特點大多數(shù)來自于土壤能形成孢子的革蘭氏陽性菌有復(fù)雜的形態(tài)（以無中隔分 枝菌絲方式生長）和生理生 命周期產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物基因組是

14、大腸桿菌的兩倍， GC含量高，平均為74%,2）鏈霉菌的載體（1）高拷貝載體 pIJ101 40-800 拷貝 硫鏈絲菌素（tsr），新霉素（neo），酪氨酸酶（mel）（2）低拷貝載體 pIJ920 1-2拷貝 廣泛宿主 能插入大于30kb的片段 （3）穿梭載體 pHJL210（SCP2*/pBR322） （4）柯斯載體（cosmid） 構(gòu)建基因文庫,（

15、5）接合轉(zhuǎn)移載體 pBR322/pIJ101/RK2（IncP）（轉(zhuǎn)移功能）（6）噬菌體載體 ?C31衍生的，如KC304， KC505（7）表達載體 利用PtipA啟動子構(gòu)建的表達載體 pIJ6021（8）分泌載體 利用S.longisporus 分泌的枯草桿菌素抑制劑subtilisin（SSI）分泌和抑制絲氨酸蛋白酶特性構(gòu)建 如pIJ702,（9）其他載體（A

16、）大容量載體 細菌人工染色體BAC 利用F因子復(fù)制起始點/par元件，1-2拷貝，克隆100-300kb的片段（B）整合型載體 利用pSAM2整合元件構(gòu)建的pPM927（C）高表達載體 整合高表達載體pCJR24，是利用天藍色鏈霉菌A3中的激活調(diào)節(jié)基因actII-ORF4與actI基因啟動子構(gòu)建的,3）鏈霉菌基因轉(zhuǎn)移的方法（1）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化率不高 ,制備過程中影響因素多,系統(tǒng)對外源DN

17、A的限制修飾作用（2）接合轉(zhuǎn)移 DNA以單鏈形式進入宿主菌 大腸桿菌S17-1菌株, 質(zhì)粒RSF1010（3）電脈沖穿孔 轉(zhuǎn)化率比原生質(zhì)體高10-100倍（4）噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo),4）鏈霉菌基因的調(diào)控和蛋白質(zhì)的分泌表達,（1）RNA聚合酶基因多樣性 天藍色鏈霉菌有兩種不同形式的RNA聚合酶全酶 ?32 （與大腸桿菌有保守性）和?49 （發(fā)育階段）多? 因子,雙啟動子 研究表明天藍色鏈霉菌至少有7個不同

18、的? 因子,參與營養(yǎng)期,孢子形成,次級代謝等,（2）調(diào)節(jié)基因A、途徑專一調(diào)節(jié)基因（pathway specific regulator）具有鏈霉菌調(diào)節(jié)蛋白新家族(SARP)正調(diào)控因子B、全局調(diào)節(jié)基因（global regulator）調(diào)控所有抗生素生物合成的調(diào)節(jié)基因absA 編碼雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（3）調(diào)節(jié)因子 小分子脂溶兼水溶的γ丁酰內(nèi)酯作為激素樣物質(zhì)激發(fā)次級代謝和/或氣生菌絲的形成,（4）鏈霉菌中的蛋白外泌系統(tǒng)

19、蛋白分泌機制大多數(shù)鏈霉菌的外泌蛋白前蛋白中有N端信號序列，它們的外泌依靠Sec-介導(dǎo)的分泌系統(tǒng)?，F(xiàn)已從鏈霉菌中已克隆了SecA，SecY，SecD，SecE和SecF類似物。SecA(Blanco etal.1998)屬于膜相關(guān)的轉(zhuǎn)位ATPase,它阻止分泌前蛋白形成三級結(jié)構(gòu)前體，促進前蛋白定位于分泌的轉(zhuǎn)位酶上。,蛋白的轉(zhuǎn)位和穿膜鏈霉菌中蛋白的轉(zhuǎn)位與穿膜機制尚未搞清，如將IL-2與tendamistat信號肽融合，在鏈霉菌中只有1/

20、20翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)位（translocation）至培養(yǎng)基和積累在胞內(nèi)。,5）影響鏈霉菌中基因表達的因素,（1）啟動子對外源基因表達的影響（2）信號肽對外源蛋白分泌的影響A、信號肽N末端氨基酸序列正電荷數(shù)對基因表達的影響B(tài)、信號肽切割位點后的氨基酸數(shù)對基因表達的影響C、信號肽和目的蛋白之間的距離對基因表達的影響,（3）密碼子、SD序列和終止子等對基因表達的影響鏈霉菌中翻譯起始密碼子為ATG或GTG，終止密碼子為TAA或TAG（4

21、）DNA擴增序列對基因表達的影響（5）發(fā)酵條件對外源基因表達的影響,6）鏈霉菌表達系統(tǒng)優(yōu)缺點及研究發(fā)展趨勢,（1）優(yōu)點：鏈霉菌工業(yè)化培養(yǎng)條件成熟,適合于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化鏈霉菌基本為非致病菌,不產(chǎn)生內(nèi)毒素可以進行高密度培養(yǎng),在穩(wěn)定期仍能維持異源蛋白的產(chǎn)生鏈霉菌可分泌胞外酶,利用信號肽可分泌外源蛋白鏈霉菌中有許多可利用的轉(zhuǎn)錄起始信號,利用它可以高表達外源基因,（2）缺點：由于研究鏈霉菌表達有生物活性的真核來源的蛋白還處于初級階段,

22、許多實驗結(jié)果不具有普遍規(guī)律,存在的問題有下列方面高活性啟動子信號肽切割位點的氨基酸序列蛋白酶的水解次級代謝可控制啟動子翻譯后加工,（3）研究發(fā)展趨勢結(jié)合基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué),完善基因表達系統(tǒng)優(yōu)化組合強啟動子,信號和先導(dǎo)肽, 從分子水平研究其結(jié)構(gòu)元件與功能的關(guān)系在蛋白水平研究蛋白的分泌機理,特別是蛋白的轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)膜機制研究次級代謝產(chǎn)物生物合成酶系的結(jié)構(gòu),構(gòu)建新化合物文庫,用于新藥的開發(fā),5、酵母菌表達系統(tǒng)（Gene Exp

23、ression system in Yeast ）,*1996年，完成了酵母基因組DNA（1.25x107bp)全序列測定工作。,Division: buddingDo not form filamentsSome form filamentsSome can mate.,1）酵母菌基因表達系統(tǒng)的宿主特點： （1） 安全無毒, 不致病。 （2）有較清楚的背景,容易遺傳操作。 （3）容易進行載體DNA的導(dǎo)入。

24、 （4）培養(yǎng)條件簡單，容易進行高密度發(fā) 酵。 （5）有良好的蛋白質(zhì)分泌能力。 （6）有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯 后的修飾功能。,2）釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,釀酒酵母是最早發(fā)展的真核基因表達系統(tǒng)。已表達和生產(chǎn)乙型肝炎疫苗、人胰島素、干擾素等。釀酒酵母的不足之處：（1）發(fā)酵時會產(chǎn)生乙醇，乙醇的積累會影響酵母本身的生長，

25、因此較難進行高密度發(fā)酵。 （2）蛋白質(zhì)的分泌能力較差。 （3）雖然能進行蛋白質(zhì)的糖基化修飾，但是與高等真核生物的相比，所形成的糖基側(cè)鏈太長。  過度的糖基化會引起副作用。,3）畢赤酵母（Pichia pastoris）,優(yōu)點：（1）可以使發(fā)酵密度達到很高的水平；（2）分泌外源基因表達產(chǎn)物的能力強；（3）糖基化修飾功能更接近高等真核生物。不足：分子生物學(xué)的研究基礎(chǔ)差，要對其進行遺傳改造困難較大；不是一種食品

26、微生物，發(fā)酵時又要添加甲醇，所以要用它來生產(chǎn)藥品或食品還沒有被廣泛接受。發(fā)酵雖然能達到很高的密度，發(fā)酵周期一般較長。,4）酵母表達系統(tǒng)研究進展,（1）外源基因在酵母中的高表達（A）提高和控制外源基因的轉(zhuǎn)錄水平 *強啟動子：磷酸甘油酸激酶基因的啟動子 （pgk1） *營養(yǎng)調(diào)節(jié)啟動子：碳源調(diào)控的gal1，gal10 基因，無機磷 調(diào)控的poh5基因 *溫控調(diào)節(jié)啟動子：sir3基因,（B）提高表達載體的

27、在細胞的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性*酵母菌的內(nèi)源質(zhì)粒：野生型2µ質(zhì)粒*核糖體DNA：rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合*單拷貝DNA片段：HIS4或AOX1介導(dǎo)（C）提高外源基因在酵母系統(tǒng)表達水平的其它因素蛋白質(zhì)分泌的調(diào)控翻譯效率；酵母偏愛密碼子；蛋白酶降解；發(fā)酵密度,（2）提高外源基因表達產(chǎn)物的的質(zhì)量（A）表達系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性（B）胞內(nèi)表達產(chǎn)物的加工和修飾（C）分泌表達產(chǎn)物的加工和修飾（3）酵母表達系統(tǒng)的新應(yīng)用（A）酵母表

28、達系統(tǒng)在人類基因組研究中應(yīng)用 (a）人類基因的功能分析（b）人類蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜分析（c）人類分泌蛋白質(zhì)和受體基因的快速篩選（B）酵母表達系統(tǒng)在藥物研究中的應(yīng)用,6、絲狀真菌表達系統(tǒng)（Gene Expression system in Filamentous Fungi）,1）載體特點：天然質(zhì)粒，多數(shù)為線性，僅在粗糙鏈孢霉發(fā)現(xiàn)有環(huán)狀質(zhì)粒。目前使用的載體還是以細菌質(zhì)粒為基本結(jié)構(gòu)。 1、營養(yǎng)選擇性標記：argB （

29、精氨酸原養(yǎng)型）和 amdS （乙酰胺利用） 2、顯性選擇性標記：G418（氨基糖苷類抗生素） 3、啟動子：從真菌基因組中篩選強啟動子, 如cbh1（纖維素生物水解酶）gpd（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）,轉(zhuǎn)化方法：（1）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 裂解酶Novozyme234，或與?-葡萄醛酸糖苷酶混合使用；滲透壓穩(wěn)定劑（如氯化鎂等無機鹽或山梨醇、蔗糖等糖）；聚乙二醇（PEG） 轉(zhuǎn)化率低，僅為10-30轉(zhuǎn)化子/ug DNA（2）電

30、擊轉(zhuǎn)化 ?-葡萄醛酸糖苷酶預(yù)處理，電擊條件，12.5kV/cm, 電容25 ? F,電阻400?。（3）共轉(zhuǎn)化 兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化在絲狀真菌中有較高的整合頻率。一個質(zhì)粒攜帶目的基因，另一個有篩選標記 。所篩選的轉(zhuǎn)化子中90%含有目的基因。,2）基因的結(jié)構(gòu)和功能,真菌的核通常為單倍體核，基因組小，約為大腸桿菌的7倍，酵母菌的2倍，僅為人類基因組的1%（一）基因轉(zhuǎn)錄（1）5’非編碼區(qū)： 核心啟動子單元,（2）CAAT保守序列 較高

31、等的真核生物中，常在位于-80bp處，發(fā)現(xiàn)GC（C/T）CAATCT保守序列，絲狀真菌常位于-100～-200bp區(qū)。（3）TATA保守序列常位于轉(zhuǎn)錄啟始點上游-40～-100bp,（4）CT含量豐富區(qū)常位于-10～-60bp （平均-20bp）（5）轉(zhuǎn)錄起始點通常有2個以上的轉(zhuǎn)錄啟始點（6）轉(zhuǎn)錄加工和翻譯帽子結(jié)構(gòu)（Cap），A?U?G?C5‘-端不翻譯mRNA約5～300bp，通常30～70bp,,,,,CAAT

32、,TATA,CT,,tsp,,ATG,（7）內(nèi)含子68%的絲狀真菌的基因含有內(nèi)含子大多數(shù)的拼接位點5‘端 GTPuNGPy 3’ 端 PyAG（8）3’非編碼區(qū) PolyA寡聚物,3）次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn),（一）β-內(nèi)酰胺抗生素 青霉素、頭孢菌素C（1）、生物合成基因克隆和調(diào)控研究 （A)編碼ACV合成酶的基因acvA(pcbAB)（?-氨基己二

33、酸-半胱氨酸-頡氨酸合成酶） 葡萄糖調(diào)控，磷酸鹽調(diào)控，銨調(diào)控（B）異青霉素N合成酶基因ipnA(pcbC),（C）異青霉素N:酰基-輔酶A?；D(zhuǎn)移酶(IAT)的基因aatA(penDE)（D）脫乙酰氧頭孢菌素C合成酶/羥化酶(DAOC/DAC)雙功能基因cefEF （E）編碼乙?；?CoA:DAC乙?；D(zhuǎn)移酶的基因cefG,(2)、應(yīng)用(A)增加基因量提高產(chǎn)量(B)引入血紅蛋白基因增加抗生素產(chǎn)量(C)工程菌直接合成

34、7-ACA或7-ADCA（二）多肽代謝物具有抗微生物和其他藥理學(xué)活性如：線狀多肽—由綠色木霉產(chǎn)生的丙甲菌素,4）發(fā)展趨勢,1、通過基因工程技術(shù)改良絲狀真菌表達系統(tǒng)，擴大遺傳背景的深入了解。2、研究絲狀真菌自身的自我復(fù)制序列，提高DNA轉(zhuǎn)化率。3、研究轉(zhuǎn)錄水平，翻譯水平和翻譯后加工的調(diào)控，增加產(chǎn)量。4、研究代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)關(guān)鍵點，最大限度的表達次級代謝產(chǎn)物，胞外酶，外源蛋白,昆蟲表達系統(tǒng)是一類應(yīng)用廣泛的真核表達系統(tǒng)，它具有同大

35、多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾、加工以及轉(zhuǎn)移外源蛋白的能力。利用重組桿狀病毒在昆蟲細胞系中表達外源蛋白是目前較為流行的表達系統(tǒng)，而另一類新型的昆蟲細胞表達系統(tǒng)，則是建立在對果蠅等昆蟲細胞進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)之上的，在穩(wěn)定性和表達效率方面有著更為突出的優(yōu)點。,7、昆蟲細胞表達系統(tǒng)（Gene Expression system in Insect Cells）,目前使用桿狀病毒表達系統(tǒng)克隆和表達了許多外源基因，例如：H5N1亞型禽流感病

36、毒血凝素、人骨形成蛋白2、人類細小病毒B19殼蛋白VP2，人尿激酶原cDNA、信號肽引導(dǎo)源基因等?？贵w分子有鼠源單克隆抗體、人鼠嵌合抗體、單鏈抗體及人單克隆抗體等多種抗體分子，還將抗體分子與尿激酶型纖溶酶原激活物等腫瘤相關(guān)蛋白進行了融合表達，這些抗體分子多數(shù)能正確組裝，完成糖基化過程，具有相當?shù)幕钚浴?1）昆蟲表達系統(tǒng)的特點,重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能 為高表達的外源蛋白在細胞內(nèi)進行正確折疊、二硫鍵的搭配及寡聚物的形成提供良好的

37、環(huán)境，可使表達產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白。 能進行翻譯后的加工修飾 對蛋白質(zhì)進行完整的翻譯后加工，包括糖基化、磷酸化、?；⑿盘栯那谐半亩蔚那懈詈头纸獾?，修飾的位點與天然蛋白在細胞內(nèi)的情況完全一致。,表達水平高 與其它真核表達系統(tǒng)相比較，此系統(tǒng)最突出的特點就是能獲得重組蛋白高水平的表達，最高可使目的蛋白的量達到細胞總蛋白的50%。 能容納大分子的插入片段 桿狀病毒粒子可以擴大，并能包裝大的基因片段，但目

38、前尚不知桿狀病毒所能容納的外源基因長度的上限。 能同時表達多個基因 桿狀病毒表達系統(tǒng)具有在同一細胞內(nèi)同時表達多個基因的能力。既可采用不同的重組病毒同時感染細胞的形式，也可在同一轉(zhuǎn)移載體上同時克隆兩個外源基因，表達產(chǎn)物可加工形成具有活性的異源二聚體或多聚體。對脊椎動物安全,3）昆蟲桿狀病毒的一般概念,（1）昆蟲桿狀病毒 是已知昆蟲病毒中的最大類群，是研究最多、實用意義最大的昆蟲病毒。它們是很多昆蟲病的病原，如家蠶的膿

39、病，同時也是農(nóng)林主要害蟲的控制因子，對它的研究具有重要的意義，目前對桿狀病毒的研究日益廣泛和深入。,（2）桿狀病毒的分類桿狀病毒因其病毒粒子呈桿狀而得名。桿狀病毒科（Baculoviridae）分為①包含體桿狀病毒亞科(Eubaculoverinae),又稱真桿狀病毒亞科；②非包含體桿狀病毒亞科(Nudibaculoverinae)。包含體桿狀病毒亞科根據(jù)其包含體的多少和形態(tài)分為核型多角體病毒屬（Nuclear Polyhed

40、rosis Virus，NPV）和顆粒病毒屬（Granulosis Virus，GV）,NPV屬按囊膜內(nèi)核衣殼數(shù)目的多少分成1）單粒包埋核型多角體病毒（SNPV）代表種：家蠶核型多角體病毒（BmNPV）2）多粒包埋核型多角體病毒（MNPV）代表種：苜蓿尺蠖核型多角體 病毒（AcMNPV）自從1983年Summers等人構(gòu)建了第一個AcMNPV重組病毒表達外源基因以來，桿狀病毒表達系統(tǒng)的分子生物學(xué)及應(yīng)用研究取得了飛速發(fā)展。,（3

41、）桿狀病毒的基因結(jié)構(gòu)以AcMNPV為例桿狀病毒基因組是共價閉合環(huán)狀的dsDNA，其基因組全長134kb，共有337個開放閱讀框，其中可以編碼多肽的區(qū)段共有137個。 生理條件下，DNA與富含Arg的堿性蛋白結(jié)合，此DNA－蛋白復(fù)合體由39KD的衣殼蛋白組成的外被所包圍，形成一個核殼體。若干個核殼體外面在包被一層脂蛋白外被就成為病毒顆粒。幾個病毒顆粒聚集成一簇，嵌在晶狀基質(zhì)中成為一個多角體包含體。,（4）桿狀病毒表達載體昆蟲桿狀病

42、毒表達載體系統(tǒng) 通常由轉(zhuǎn)移載體、親本病毒和重組介質(zhì)三部分組成。其技術(shù)路線分以下幾步: （A）將外源片段克隆到載體質(zhì)粒中，置于桿狀病毒啟動子控制之下，上下游各有一段與親本病毒DNA 相匹配的側(cè)翼序列，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體；（B）把轉(zhuǎn)移載體和野生型病毒共轉(zhuǎn)染入昆蟲細胞，通過同源重組將外源片段插入到病毒基因組，以特定的篩選標記和方法獲得重組病毒。（C）當重組病毒在受體細胞內(nèi)復(fù)制時，外源片段也得到了表達。最后空斑純化重組病毒，擴大培養(yǎng)，分離、純

43、化所表達的外源蛋白。,轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建由于AcMNPV基因組的巨大，不可能用單一的限制性酶切位點來對它進行操作，所以目前使用的桿狀病毒表達載體系統(tǒng)大多采用構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體（transfer vector）。將病毒非必需基因polh基因克隆到一個大腸桿菌質(zhì)粒中，利用限制性內(nèi)切酶和DNA外切酶或者PCR的方法，除去部分或全部polh基因編碼序列，保留完整的啟動子部分和多角體基因下游序列，即多角體基因側(cè)翼序列，之間加入單一或者多克隆位點，可以插入

44、外源基因。,桿狀病毒分子量大，不能象質(zhì)粒載體一樣利用多克隆位點進行基因重組，而只能利用桿狀病毒和帶有目的基因序列的質(zhì)粒載體進行共轉(zhuǎn)染。以野生型桿狀病毒ＤＮＡ(ＡＣＭＮＰＶ)進行共轉(zhuǎn)染時重組率極低,僅有0 .1%.,,利用線形化的病毒載體可將重組率提高到30%。在部分載體中引入了β-半乳糖苷酶基因后可以利用插入失活結(jié)合藍白斑進行重組體的篩選。BaculogoldTM是一種缺失衣殼蛋白編碼序列ＯＲＦ1629部分序列的缺失致死型突變體,此ＤＮ

45、Ａ與基于多角體蛋白位點的轉(zhuǎn)移載體對細胞進行共轉(zhuǎn)染時,只有發(fā)生同源重組的病毒才有復(fù)制能力.,果蠅表達系統(tǒng)( Drosophila expression system ，DES)包含表達載體和相應(yīng)的選擇載體。通過表達載體和選擇載體的共轉(zhuǎn)染, 可在3～4 周時間內(nèi)獲得表達重組蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系. 而且通過優(yōu)化表達載體和選擇載體的比例, 可以得到含有高拷貝數(shù)目的基因的細胞系, 從而提高目的蛋白的表達量。,以前人們認為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆

46、蟲細胞中復(fù)制，不能在其他昆蟲細胞(如果蠅細胞)中復(fù)制，然而研究表明在一定條件下，桿狀病毒也能感染果蠅細胞。在果蠅細胞中，桿狀病毒的多角體基因啟動子幾乎不發(fā)生作用，利用的是果蠅啟動子如Hsp70啟動子、肌動蛋白5C啟動子、金屬硫蛋白基因啟動子等，其中，Hsp70啟動子的作用最強。重組桿狀病毒感染果蠅細胞后不會引起宿主細胞的裂解，且蛋白表達水平與鱗翅目細胞相似，因此，桿狀病毒-果蠅系統(tǒng)是一個很有應(yīng)用前景的昆蟲細胞表達系統(tǒng)。,4）昆蟲細胞培養(yǎng)

47、和重組蛋白表達,（1）昆蟲細胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件所有的昆蟲細胞培養(yǎng)基都含有基本鹽類，糖類，氨基酸，有機酸，維生素以及微量元素。通常用的商品培養(yǎng)基有Grace培養(yǎng)基，呈粉狀。配制培養(yǎng)基的時候要加入10％胎牛血清（FBS）和酵母水解物（YL）和水解乳蛋白（LH）昆蟲細胞一般在27℃生長最佳，培養(yǎng)基pH是6.2，無需CO2。多數(shù)昆蟲細胞的倍增時間是18－22h,,（2）昆蟲細胞的大規(guī)模懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞比較容易在實驗室小規(guī)模水平上（10

48、0－1000ml），在磁力攪拌瓶中生長，其密度一般可以達到3×106/ml，活力在95％以上。氧的供給：在成批培養(yǎng)的密閉容器中需解決通氧，而且在培養(yǎng)感染重組病毒的昆蟲細胞時耗氧量比未感染的要高。細胞保護：由于昆蟲細胞對于剪切力和產(chǎn)生氣泡的敏感性，細胞容易破裂，化合物PluronicF－68可以保護細胞因上述原因造成的損傷。其它因素：還有好多因素要考慮，如反應(yīng)器的設(shè)計，細胞密度，培養(yǎng)基成分，病毒感染的條件等。,,（3）病毒

49、感染和基因表達 由于昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白是一種間歇性的程序進行生產(chǎn)的，因為所有細胞都會因病毒感染而引起病理性死亡，因此，在生產(chǎn)時往往需要至少有兩個反應(yīng)器：第一個反應(yīng)器培養(yǎng)正常的昆蟲細胞，第二個反應(yīng)器用于病毒接種感染表達。,利用桿狀病毒的極早期基因ie基因啟動子構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體，由于病毒極早期基因啟動子的轉(zhuǎn)錄可以直接利用宿主細胞的RNA polymerase II，所以用這樣的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化昆蟲細胞，使昆蟲細胞能夠持續(xù)表達

50、外源蛋白。,5）桿狀病毒表達載體系統(tǒng)的新應(yīng)用,（1）廣泛用于在昆蟲細胞中表達各種重組蛋白。昆蟲桿狀病毒表達載體系統(tǒng)于20世紀80年代初期問世以來，在20多年的時間里已成為生產(chǎn)與研究各種原核、真核蛋白有力而普及的工具。,（2）用于桿狀病毒表面的蛋白展示，建立蛋白庫，簡化單克隆抗體的純化和蛋白與受體相互作用的研究。 有潛力的應(yīng)用是病毒表面的蛋白展示功能（protein display）。將外源基因插入到桿狀病毒表面糖蛋白gp67

51、的信號肽與成熟蛋白編碼序列之間，不破壞它本身的轉(zhuǎn)運及膜融合功能，從而作為載體將外源蛋白展示在病毒粒子表面。,（3）構(gòu)建含有哺乳動物啟動子的重組桿狀病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細胞，作為良好的基因轉(zhuǎn)移載體，用于基因轉(zhuǎn)移和基因治療。 桿狀病毒可以被非宿主細胞如哺乳動物細胞所吞飲，但是不能在非宿主細胞中復(fù)制。帶有哺乳動物啟動子的重組桿狀病毒可以轉(zhuǎn)導(dǎo)原代培養(yǎng)的肝細胞，并表達報告基因。根據(jù)桿狀病毒在哺乳動物細胞中的特點，作為基因傳遞載體

52、，可以將帶有p53基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Saos－2 human osteosarcoma細胞，100％的轉(zhuǎn)化細胞都能表達p53基因，這就為體內(nèi)利用基因治療法治療癌癥等疾病提供了途徑。,盡管昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)存在一些不足之處，但它在農(nóng)業(yè)、基礎(chǔ)分子生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有極其重要的作用。利用不斷發(fā)展的新技術(shù)將其改造為較高效的殺蟲劑仍然具有極其誘人的前景。另外，隨著對這一表達系統(tǒng)本身的基礎(chǔ)理論研究的不斷深入，其調(diào)控機理也將越來越清晰明了，

53、新的調(diào)控因子及強的增強子也可能被找到，這將極大地提高蛋白的表達效率。,8、 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)（Gene Expression system in Mammals）,1）特點糖基化等翻譯后修飾。能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，目的基因在哺乳動物細胞中表達的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白。,2）表達載體,病毒載體：以病毒顆粒的方式，通過病毒包膜蛋白與宿主細胞膜的相互作用使外源基因進入到細胞內(nèi)。常用

54、的病毒載體有腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、semliki森林病毒(SFV)載體等。,3）高效表達載體構(gòu)建,（1）轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控 （A）利用病毒源性和細胞源性的強啟動子，如mCMV、hCMV、hEF-lα、人的c-fos、雞胞漿-β肌動蛋白等啟動子。CMV啟動子在細胞處于S期、生長迅速時，轉(zhuǎn)錄活性最高；但在大規(guī)模生產(chǎn)的中、后期，外源基因的表達水平下降。此時，pEF-1 α啟動子的轉(zhuǎn)錄起始效率更強。,（B）利用啟動子、增強子元件構(gòu)建雜

55、合啟動子Masayuki等發(fā)現(xiàn)CMV增強子能提 高hEF-1 α啟動子控制下的目的基因表達量4-9倍 。Kim等發(fā)現(xiàn)將hEF-1 α啟動子的第1個內(nèi)含子置于mCMV啟動子與目的基因(熒光素酶)之間能極大地提高目的基因在CHO細胞中的表達，使熒光素酶的表達量提高了8.2倍。,（C）提高宿主細胞轉(zhuǎn)錄因子的表 達水平EGF能提高EF-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄量和蛋白質(zhì)的表達。Reza等將用作結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域-鋅指結(jié)構(gòu)

56、和VP16蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)建了人工轉(zhuǎn)錄激活因子，將CMV啟動子的轉(zhuǎn)錄效率提高了2倍多。,（2）翻譯水平的調(diào)控 mRNA壽命、mRNA的翻譯起始效率和翻譯產(chǎn)物的加工修飾的效率等也對目的基因的表達產(chǎn)生重要的影響。（A）內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)能使 同一mRNA中除第1個基因之外 的其他基因也得到有效表達。（B）翻譯增強子可提高翻譯效率。（C）使用宿主細胞偏愛的密碼子來

57、 對目的基因的密碼子進行優(yōu)化。,（3）整合位點的優(yōu)化目的基因在CHO細胞染色體上整合位點區(qū)域的狀態(tài)對于目的基因的表達與否、表達高低以及目的基因在宿主細胞中的穩(wěn)定性起著決定性的作用。只有那些整合位點處于染色體轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)的細胞形成的克隆才可高水平表達目的基因。,（A）選擇基因(如 neo)的弱化表達，使大量整合在低表達整合位點的細胞由于選擇標記基因表達量不夠而在選擇培基條件下死亡。（B）在載體上添加染色體上的某些特定

58、序列(如骨架/基質(zhì)附著區(qū))，使表達載體整合到宿主細胞的染色體后能模擬染色體的高轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)。,3）宿主細胞,常用的幾種用于表達重組蛋白的細胞株BHK-21細胞 CHO-K1細胞C127細胞 MDCK細胞Namalwa細胞 Vero細胞鼠骨髓瘤細胞 COS細胞 骨髓瘤細胞株(如Sp2/0和J558L) 不同的細胞對重組蛋白的修飾可能會稍有差別。,發(fā)現(xiàn)新細胞株：

59、 來源于Madin-Darby犬腎的高分化內(nèi)皮細胞株(MDCK)，表達分泌型的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP13。高表達的陽性細胞克隆可占轉(zhuǎn)染細胞的5％～l0％，而同樣的載體在CHO細胞中僅得到低水平的表達。,對現(xiàn)有細胞株進行遺傳改造： 基于腺病毒E1A蛋白可反式激活CMV啟動子，Cockett等建立了穩(wěn)定表達E1A的CHO細胞株，在該細胞中重組前膠原酶的產(chǎn)量與CHO細胞相比增加了12倍。,4)常用的細胞表達系統(tǒng)(1)CHO/DHFR和

60、CHO/NEOSPLA 表達系統(tǒng)（2）C127/BPV-1系統(tǒng)（3）骨髓瘤細胞表達系統(tǒng),5）表達系統(tǒng)方式,（1）瞬時表達系統(tǒng)：宿主細胞在導(dǎo)入表達載體后不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA隨細胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達時限短暫。簡捷，實驗周期短，規(guī)模大。技術(shù)條件要求高，如質(zhì)粒的純度、轉(zhuǎn)染的效率等。,（2）穩(wěn)定表達系統(tǒng)：載體進入宿主細胞并經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA穩(wěn)定存在于細胞內(nèi)，目的蛋白的表達持久、穩(wěn)定。由于需抗性選

61、擇甚至加壓擴增等步驟，穩(wěn)定表達相對耗時耗力。,（3）誘導(dǎo)表達系統(tǒng)：目的基因的轉(zhuǎn)錄受外源小分子誘導(dǎo)后才得以開放。早期—糖皮質(zhì)激素、重金屬離子—特異性低、毒性高。近年—非哺乳動物細胞來源的調(diào)控蛋白—外源基因表達低、誘導(dǎo)效應(yīng)高。,6）基因的導(dǎo)入方法光穿孔法 沖擊波法基因槍法 穿孔法磷酸鈣共沉淀法 脂質(zhì)體法抗體轉(zhuǎn)染法 其他,7）展望

62、（一）改進表達載體，提高表達水平和產(chǎn)量 1.采用更強的啟動子和增強子 2.更好地利用擴增系統(tǒng)獲尋找高表達位點 3.采用和改造更好的宿主細胞（二）利用代謝工程，改進培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本 1.采用“代謝工程”改造工程細胞 2.改進培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本（三）抑制細胞調(diào)亡，延長培養(yǎng)時間（四）采用“糖基化”工程，提高產(chǎn)品質(zhì)量,9、植物生

63、物反應(yīng)器（Plant Bioreactor）,植物生物反應(yīng)器是指通過基因工程途徑，以常見的農(nóng)作物作為“化學(xué)工廠”，通過大規(guī)模種植生產(chǎn)具有高經(jīng)濟附加值的醫(yī)用蛋白、工農(nóng)業(yè)用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂類及其它一些次生代謝產(chǎn)物等生物制劑的方法。,1）植物生物反應(yīng)器的優(yōu)點,植物生物反應(yīng)器的廉價性植物生物反應(yīng)器的安全性植物具有真核生物的加工修飾能力植物生產(chǎn)系統(tǒng)的實用性,2）植物生物反應(yīng)器的生產(chǎn)流程,目前，利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)

64、器生產(chǎn)藥用蛋白的領(lǐng)域方向主要有三個：一是藥用蛋白，二是醫(yī)用抗體，三是疫苗。 原理是將目的基因?qū)胫参铮蛊湓谥参镏斜磉_，人或動物攝取該植物或其中的蛋白后達到預(yù)期目的。,3）植物反應(yīng)器的載體系統(tǒng),4）植物遺傳轉(zhuǎn)化方法,載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化,基因直接轉(zhuǎn)化,病毒載體,農(nóng)桿菌質(zhì)粒,鳥槍法,PEG介導(dǎo),,,,,,形成愈傷組織進而完整的轉(zhuǎn)化植株轉(zhuǎn)化率高，但外源基因穩(wěn)定性差,“裸露細胞”，全能性易操作，效率高，但遺傳穩(wěn)定性更差，周期長,花粉細胞、

65、卵細胞 單倍體培養(yǎng)或利用受精過程導(dǎo)入較強的接受外源DNA能力，但受季節(jié)限制,5）植物轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng),幾點關(guān)鍵問題基因表達的有效性 啟動子的選擇—組成型啟動子花椰菜花葉病毒（CaMV）的35啟動子，活性高且能穩(wěn)定表達。 信號肽—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽（SP）、C末端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列等 標記序列—C-myc、組蛋白等2. 基因表達的穩(wěn)定性 不斷選擇高水平表達外源蛋白量的株系； 選

66、擇具有良好貯藏功能的器官作為植物反應(yīng)器的表達部位,3、重組蛋白的純化 口服疫苗—不需要精確的提純 基因融合—定向引導(dǎo)重組蛋白于特定細胞器或組織，簡化提純步驟 4、重組產(chǎn)物的特性 糖基化模式的差別—去除N-糖基 5、大田生產(chǎn)的風(fēng)險評估 抗性基因，轉(zhuǎn)基因擴散，轉(zhuǎn)基因作物安全,6）植物生物反應(yīng)器的特點,7）前景展望,隨著新功能基因的分離、克