細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死

1、細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死,細(xì)胞凋亡（科普詩(shī)）,似秋葉的凋零，告別生命之輝煌；那難以計(jì)數(shù)的攻擊、誘導(dǎo)，輕啟著道道程序，逼細(xì)胞步步走向生命的末端；啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點(diǎn)一點(diǎn)擰淡;,細(xì)胞凋亡（科普詩(shī)）,似秋葉的凋零，告別生命之輝煌；那難以計(jì)數(shù)的攻擊、誘導(dǎo)，輕啟著道道程序，逼細(xì)胞步步走向生命的末端；啊，活性氧處處肆虐，鈣波濤驚石裂岸，線粒體把生命之光一點(diǎn)一點(diǎn)擰淡;,危難中的細(xì)胞啊，你沉穩(wěn)

2、不亂，DNA片片切割，化云梯直通天堂；細(xì)胞體分團(tuán)相聚，把生命的凝重濃集在小體上；分別了朝夕相處的伙伴，再見(jiàn)了快樂(lè)美好的時(shí)光；這一切的一切又融入臨近的胞體，騰出的空間再寫生命的篇章。,細(xì)胞死亡形式,1. 細(xì)胞壞死 由于比較強(qiáng)烈的有害刺激或細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的嚴(yán)重紊亂而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。2. 細(xì)胞凋亡 由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過(guò)程稱為細(xì)胞凋亡（apoptosis),又稱程序性細(xì)胞死亡（programm

3、ed cell death,PCD)。,細(xì)胞凋亡與壞死的比較,細(xì)胞凋亡的生理和病理意義,1.確保正常發(fā)育、生長(zhǎng):指趾間隙形成；2.維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定:組織細(xì)胞更新(上皮組織/血細(xì)胞/衰老細(xì)胞)、生理器官內(nèi)分泌調(diào)控（子宮產(chǎn)后復(fù)員/月經(jīng)期子宮內(nèi)膜脫落）、受損不能修復(fù)細(xì)胞或突變細(xì)胞清除；3.發(fā)揮積極的防御功能：病原微生物的宿主細(xì)胞發(fā)生主動(dòng)凋亡。,細(xì)胞凋亡與疾病發(fā)生機(jī)制的新認(rèn)識(shí),1.該“死”的細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞、自身反應(yīng)性免疫細(xì)胞）未死，是造成腫

4、瘤、自身免疫性疾病的主要發(fā)病機(jī)制之一。——細(xì)胞凋亡不足2.不該“死”的細(xì)胞（如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞）死了，這與老年性癡呆、心肌缺血/再灌注損傷等發(fā)病有關(guān)?！?xì)胞凋亡過(guò)度,細(xì)胞凋亡的過(guò)程,1.凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)2.凋亡基因激活3.細(xì)胞凋亡的執(zhí)行4.凋亡細(xì)胞的清除,凋亡過(guò)程及分期誘導(dǎo)期 執(zhí)行期 消亡期,凋亡誘導(dǎo)因素,,受體,

5、,cAMPCa2+神經(jīng)酰胺,,死亡信號(hào),凋亡相關(guān)基因激活,,,Dnase激活Capases激活,,巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞凋亡細(xì)胞,凋亡時(shí)細(xì)胞的主要變化,一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變1.細(xì)胞膜的變化：微絨毛、細(xì)胞突起和細(xì)胞表面皺褶消失；胞膜空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不斷擴(kuò)張并與胞膜融合形成芽狀突起（出芽）；2.細(xì)胞質(zhì)變化：胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞器變化（線粒體變大脊增多可空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)大提供包裹膜）；3.細(xì)胞核變化：核內(nèi)

6、染色質(zhì)濃縮邊集空泡化、固縮、出芽、邊集、凋亡小體（apoposis boby）,,最早期形態(tài)學(xué)改變是細(xì)胞間的間接丟失 與鄰近細(xì)胞脫離并失去微絨毛 胞漿濃縮及核質(zhì)密度增高 （DNA斷裂） 凋亡小體 識(shí)別、吞噬（無(wú)炎癥反應(yīng)）,,,,,,,典型的凋亡小體（apoposis boby）：由透亮空泡和不透光的濃密的核碎片兩部分組成。,胸腺細(xì)胞,正常,凋亡,胸腺細(xì)胞,正常,凋亡,細(xì)

7、胞凋亡的生化改變,1.DNA的片段化“梯”狀條帶2.內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活及其作用3.凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用,1.DNA的片段化“梯”狀條 帶為細(xì)胞凋亡主要特征,①幾乎所有凋亡細(xì)胞均有核小體間的裂 解，導(dǎo)致DNA 的斷裂；②DNA降解過(guò)程的特異性：不伴有組蛋 白和其它核蛋白的降解；③染色質(zhì)在核小體間的裂解是凋亡細(xì)胞 和形態(tài)改變的基礎(chǔ)；④DNA 片段化是凋亡的“黃金標(biāo)記”。,2.內(nèi)源性核

8、酸內(nèi)切酶激活及其作用,由一系列胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)節(jié)激活，執(zhí)行染色質(zhì)DNA切割,3. Caspase 9 激活，需要通過(guò)CARD（caspase-recruitment domain)、Apaf-1、細(xì)胞色素c、ATP等多個(gè)因子的參與,1.滅活細(xì)胞凋亡的抑制物（如Bcl-2）；2.水解細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞解體，形成凋亡小體（apoposis boby）；3.在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中水解相關(guān)活性蛋白，使該蛋白獲得或喪失某種生物學(xué)功能,Cas

9、pases在凋亡中的主要作用,細(xì)胞凋亡的調(diào)控,（一）細(xì)胞凋亡相關(guān)因素 1.誘導(dǎo)性因素 2.抑制性因素 (二) 細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),1.細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因素,.生理活性因子：TNF家族（Fas-L,TNF)、 TGF、神經(jīng)遞質(zhì)(谷氨酸、多巴胺)、生長(zhǎng)因子撤退、GC等 .損傷相關(guān)因

10、子：熱休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射線等.化療藥物.毒素：乙醇、β -淀粉樣肽,2.細(xì)胞凋亡的抑制因素,.凋亡相關(guān)基因的抑制作用：p53、bcl-2、bcl-XL等。.生理性抑制劑：生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)、鋅、雄激素、雌激素等.病毒基因：腺病毒E1B、桿狀病毒p35、棒狀病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBV BHRF1等.藥物：Calpain抑制劑、caspases抑制劑、促癌劑、佛波豆蔻乙脂(PMA)等,(二)

11、細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo) -凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)特點(diǎn),① 多樣性：不同種類的細(xì)胞系統(tǒng)不同② 偶聯(lián)性：與增殖分化的信號(hào)系統(tǒng)交叉偶聯(lián)③ 同一性：多因素，共用同一系統(tǒng)觸發(fā)④ 多途性：同一誘導(dǎo)因素啟動(dòng)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,㈡細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),誘導(dǎo)信號(hào),,cell,R,,,神經(jīng)酰胺,,,,多途徑,R,SAPK/JNK,,P53 基因,,NF-kB,JNK/AP-1途徑,,激活bax or 下調(diào)bcl-2,,,,ROS,mtDNA,,

12、㈢ 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因,抑制凋亡基因：bcl-2促進(jìn)凋亡基因： fas，P53雙向調(diào)控基因： c-myc，bclx,Bcl-2抗凋亡機(jī)制,①直接的抗氧化②抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì)③抑制促凋亡的Bax，Bak細(xì)胞毒作用④抑制Caspases激活⑤維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài),細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制,（一）氧化損傷（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡 (三) 線粒體損傷,（一）氧化損傷機(jī)制,氧自由基可破壞機(jī)體正常的氧化/還原的動(dòng)態(tài)平衡，造成生物大分子的氧化

13、損傷，干擾正常的生命活動(dòng)，形成嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)——后果：誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。,（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細(xì) 胞凋亡的可能機(jī)制,1.激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶(DNase)，降解DNA鏈；2.激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化細(xì)胞內(nèi)肽鏈間的?；D(zhuǎn)移，在肽鏈間形成共價(jià)鍵，使細(xì)胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成；3.激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄；4.Ca2+在ATP的配合下使DNA鏈?zhǔn)嬲?，暴露出?/p>

14、小體之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點(diǎn)，有利于DNA內(nèi)切酶切割DNA。,細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義,1.發(fā)育 從低等動(dòng)物到高等動(dòng)物的發(fā)育，都存在著程序性細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。2.免疫系統(tǒng) 淋巴細(xì)胞發(fā)育分化成熟過(guò)程中，始終伴隨著細(xì)胞凋亡。3.衰老 細(xì)胞凋亡與許多年齡相關(guān)疾病有直接或間接的聯(lián)系。4.損傷與修復(fù) 5.腫瘤發(fā)生 細(xì)胞增殖與死亡的速度平衡失調(diào)。6.病毒致病 病毒表達(dá)抗凋亡蛋白。,細(xì)胞凋亡的檢測(cè),隨著研究技術(shù)的提高和對(duì)凋亡的認(rèn)識(shí)不斷深入，檢

15、測(cè)凋亡的方法已從細(xì)胞、染色質(zhì)到分子水平日趨完善和成熟。1.形態(tài)學(xué)檢測(cè)2.DNA降解分析3.凋亡酶學(xué)分析4.凋亡相關(guān)蛋白分析5.流式細(xì)胞分析,一．細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)分析,細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化主要表現(xiàn)為：細(xì)胞皺縮(cell shrinkage)，失去細(xì)胞連接(cell junction)，微絨毛(microvilli)消失，發(fā)泡(blebbing)，染色質(zhì)濃集并靠近核膜，形成沿核膜收縮的新月?tīng)铙w(crescents)，形成凋亡小體(

16、apoptotic body)等。,細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法,二. DNA降解分析,DNA降解過(guò)程的特點(diǎn)：1. 發(fā)生于凋亡早期，由內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活引起2. DNA在核小體連接部位斷裂，產(chǎn)生180－200bp為最小單位的單體或寡聚體片斷3. DNA碎片可被細(xì)胞膜包裹，形成凋亡小體,,(一) DNA凝膠電泳 原理：凋亡細(xì)胞降解產(chǎn)生一系列規(guī)則的DNA片斷，其電泳結(jié)果呈典型的“ 梯狀帶”(ladder)；而壞死或凋

17、亡后壞死細(xì)胞的DNA分解是隨機(jī)的，產(chǎn)生的碎片分子量大小不一，在電泳時(shí)形成“ 涂片狀”(smear)。 普通瓊脂糖凝膠電泳、Southern blotting、放射自顯影(32PdATP或32PdCTP連接到DNA片斷的3’ 端),(二)原位標(biāo)記法TUNEL(TdT mediated dUTP nick end labeling)終末脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)。原理：在TdT的作用下，帶有標(biāo)記物的d

18、UTP被連接在斷裂DNA3’末端，然后通過(guò)相應(yīng)的方法檢測(cè)標(biāo)記物，從而判斷是否有凋亡發(fā)生。應(yīng)用范圍：石蠟包埋的組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)細(xì)胞、組織中分離的細(xì)胞,(三) ELISA法 原理：以抗組蛋白抗體包被微孔板壁，加入標(biāo)本，凋亡細(xì)胞的核小體可與抗體結(jié)合，再加入抗-DNA片斷-POD復(fù)合物，與核小體中的DNA片斷結(jié)合，最后加入POD顯色底物，以酶標(biāo)儀測(cè)定光密度以進(jìn)行定量分析。,三. 凋亡酶學(xué)分析,1. 內(nèi)切核酸酶(e

19、ndonuclease, DNase) 種類：DNase Ⅰ （內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體), DNase Ⅱ（溶酶體、胞核)，NUC18（胞核，胸腺細(xì)胞中) 等 作用：使DNA斷裂成180－200bp或其倍數(shù)的片斷 激活機(jī)制：CAD(caspase-activate DNase) ICAD(inhibtor of CAD) 檢測(cè)：Western Bl

20、otting,Caspases的檢測(cè) 1. Caspase-3活性測(cè)定(FIENA法) 熒光測(cè)定免疫吸附法(flurometric immunosorbent enzyme assay, FIENA), caspase-3可作用于連接熒光素的特異底物－乙?；於彼?谷氨酸-頡氨酸-天冬氨酰胺(Ac-DEVD), 產(chǎn)生發(fā)熒光的裂解產(chǎn)物AFC，且caspase-3活性與Ac-DEVD-AFC分解的量或自由熒光A

21、FC產(chǎn)生熒光的強(qiáng)弱成正比，故可定量檢測(cè) 2. 蛋白印跡法 Caspases作用底物的檢測(cè) PARP89kD的檢測(cè),四. 凋亡相關(guān)蛋白分析,1. Bcl-2家族 促進(jìn)凋亡：Bax, Bal, Bcl-Xs, Bad, Bid, Bik, Bim, Hrk, Bok等 抑制凋亡：Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, A1/Bfl-1等 均含有BH(Bc

22、l-2 homology)結(jié)構(gòu)域，通過(guò)此結(jié)構(gòu)域以二聚體形式調(diào)控凋亡。2. 其他相關(guān)蛋白 p53, Myc, Fas等,五、流式細(xì)胞分析,（Flow Cytometry，F(xiàn)CM） 利用流式細(xì)胞儀對(duì)處在快速、直線、流動(dòng)狀態(tài)中的單細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同時(shí)對(duì)特定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。,FCM分析細(xì)胞凋亡的方法,一. 細(xì)胞形態(tài)分析二. 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能改變分析三. 細(xì)胞DNA含量分