蛋白質(zhì)各種定量方法的優(yōu)缺點(diǎn)的比較

1、蛋白質(zhì)各種定量方法的優(yōu)缺點(diǎn)的比較蛋白質(zhì)各種定量方法的優(yōu)缺點(diǎn)的比較1蛋白質(zhì)的常規(guī)檢測(cè)方法蛋白質(zhì)的常規(guī)檢測(cè)方法1.1凱氏（凱氏（Kjeldahl）定氮法）定氮法一種最經(jīng)典的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。原理原理：樣品中含氮有機(jī)化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生氨氨又與硫酸作用變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨氨用過量的硼酸溶液吸收再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：范圍廣泛、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好缺點(diǎn)缺點(diǎn)：操作復(fù)雜費(fèi)

2、時(shí)、試劑消耗量大1.2雙縮脲法雙縮脲法常用于需要快速但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)檢測(cè)。原理原理：雙縮脲（NH3CONHCONH3）是3分子的脲經(jīng)180℃左右加熱，放出1分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與硫酸銅形成紫色絡(luò)合物（肽鍵中的氮原子和銅離子配價(jià)結(jié)合），稱為雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍：1~10mg（有的文獻(xiàn)記載為1~20mg）優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：較快速，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)

3、產(chǎn)生的顏色深淺相近缺點(diǎn)缺點(diǎn)：①靈敏度差；②三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會(huì)干擾該反應(yīng)。1.3Folin酚試劑法酚試劑法原理：原理：Folin酚法的原理與雙縮脲法大體相同，利用蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)。同時(shí)也由于Folin酚試劑中的磷鉬酸磷鎢酸試劑被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物。在一定的條件下藍(lán)色深度與蛋白的量成正比，由此可測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。測(cè)定范圍：20~250ug優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：靈

4、敏度高，對(duì)水溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定很有效缺點(diǎn)缺點(diǎn)：①費(fèi)時(shí)，要精確控制操作時(shí)間；②Folin酚法試劑的配制比較繁瑣且酚類和檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油、還原劑(二硫代蘇糖醇、巰基乙醇)、EDTA和脲素均會(huì)干擾反應(yīng)。3.蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法3.1鄰位連接技術(shù)鄰位連接技術(shù)原理原理：首先將不同的DNA單鏈分別與蛋白質(zhì)識(shí)別分子相結(jié)合形成PLA探針，經(jīng)過類似酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）中的溫育過程

5、，2條含有不同DNA序列的PLA探針會(huì)同時(shí)結(jié)合到同一個(gè)待測(cè)蛋白質(zhì)分子上。此時(shí)，2條探針的DNA尾部便在空間上緊密靠近。在過量的互補(bǔ)連接序列和NDA連接酶的作用下，2條探針DNA尾部的游離5’端和3’端與互補(bǔ)序列雜交并發(fā)生連接反應(yīng)，形成一個(gè)環(huán)狀的蛋白質(zhì)蛋白識(shí)別分子單鏈DNA復(fù)合物。該復(fù)合物量的多少，完全取決于樣品中待測(cè)蛋白質(zhì)分子的量，故可用于蛋白質(zhì)的定量分析。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)特異性強(qiáng)、樣品損耗低、操作簡單、檢測(cè)設(shè)常見3.2核酸

6、適體核酸適體原理原理：直接在核酸適體上共價(jià)修飾熒光基團(tuán)，利用它與靶分子結(jié)合時(shí)熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)靶分子的檢測(cè)。修飾有熒光熄滅基團(tuán)的核酸適體探針通過靜電作用與陽離子熒光共軛聚合物結(jié)合，導(dǎo)致后者熒光熄滅，當(dāng)加入靶蛋白后，核酸適體探針與其特異性結(jié)合，熒光熄滅基團(tuán)與陽離子熒光共軛聚合物遠(yuǎn)離，聚合物熒光信號(hào)得以恢復(fù)。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)限低，檢測(cè)線性范圍廣3.3電泳法電泳法原理原理：電泳法就是指帶電荷的供試品（如蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如濾紙

7、、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，在電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，由于各組分之間的移動(dòng)速度不同，使各組分分離成狹窄的區(qū)帶，并用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、快速、樣品用量少、高自動(dòng)化。缺點(diǎn)缺點(diǎn)：存在核酸、多糖、脂類等干擾分子，影響檢測(cè)結(jié)果。3.4二甲酸喹啉（二甲酸喹啉（BCA）法）法原理原理：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)將Cu2還原成Cu，BCA與Cu結(jié)合形成穩(wěn)定的藍(lán)