細(xì)胞克隆形成實驗

1、正德利用厚生惟和細(xì)胞克隆形成實驗細(xì)胞克隆形成實驗當(dāng)單個細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，成為集落或克隆。每個克隆含有50以上的細(xì)胞，大小在0.31.0mm之間。集落形成率表示細(xì)胞的獨立生存能力。各種理化因素可能導(dǎo)致細(xì)胞的克隆形成能力發(fā)生改變。通過一定的實驗方法可以對細(xì)胞的克隆形成能力進行檢測。細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。

2、克隆形成率反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大：一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強。實驗方法：實驗方法：平板集落形成實驗、軟瓊脂集落形成實驗(a)平板集落形成實驗：本法適用于貼壁生長的細(xì)胞和正常培養(yǎng)的細(xì)胞(b)軟瓊脂集落形成實驗：本法適用于非錨著依賴性生長的細(xì)胞，如骨髓造血干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞株、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。

3、正德利用厚生惟和(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2DMEM培養(yǎng)基(含有2抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃5%CO2溫箱中培養(yǎng)1

4、0～14天。(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)。計算形成率。軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。試驗中瓊脂與細(xì)胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細(xì)胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細(xì)胞。正常細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。軟瓊脂集落形成率實驗(軟瓊脂克隆)將1.2％低熔點瓊脂糖與2細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0.6％的底層瓊脂，6孔板中每個孔1.4ml溫室凝固

5、，取對數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后吹散成單個細(xì)胞懸液，計數(shù)，并調(diào)細(xì)胞濃度為10000個ml，將0.6％低熔點瓊脂糖與2細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合，制備0.3％的上層瓊脂，每孔加1ml上層瓊脂和100ul單細(xì)胞懸液（約1000cellwell)，混勻，室溫凝固。置于37℃，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2－3周，計數(shù)含50個細(xì)胞以上得克隆，計算細(xì)胞集落形成率，SpotII采集圖像。注意事項注意事項1.接種時細(xì)胞密度適度，不可過高。2.軟瓊脂與細(xì)