質粒構建小竅門

1、重組質粒構建是常用的分子生物學手段，其實只是最基本的方法，一般一個星期同時構建三二個組質粒是沒有問題的。在國內(nèi)先進的實驗中，也大都是由實驗員搞定。但是其中還是有些基本的技巧需要掌握。在這里將我的心得分享于大家，這也是我本人幾年來一線工作時的經(jīng)驗積累，以期能為谷友提供借鑒，讓大家在實驗中少走彎路。所涉及內(nèi)容如下：1)克隆基因的酶切位點問題2)載體酶切的問題3)連接片段濃度比的問題在闡明上述問題同時，本人盡可能舉些實驗中的問題案例予以說明。

2、一、克隆基因的酶切位點問題1、克隆位點選擇的問題。首先要對目標基因進行酶切位點掃描分析，列出其所含酶切位點清單。然后對照質粒多克隆位點，所選擇的克隆位點必須是目標基因所不含的酶切位點。這是常識，不贅述。2、保護堿基數(shù)目的問題。在設計PCR引物時，引入酶切位點后，常常要加入保護堿基，這是大家所熟知的。但是保護堿基數(shù)量多少，可能被新手所忽視。這種忽視碰可能會大大影響后續(xù)的實驗進展。一般情況下，普通的內(nèi)切酶只加入兩個保護堿基，其內(nèi)切反應就可以

3、正常進行；而有一類，僅僅只加入兩個保護堿基，其內(nèi)切反應就不能正常進行，這是因為內(nèi)切酶不能正常結合DN段上。如NdeI就屬這類，需要加入至少6個保護堿基，常用的HindIII也要三個。下面是我提供這類酶的列表及其所需最少的保護堿基數(shù)，相信下列將有助于大這家的實驗設計。NcoI4NdeI6NheI3NotI8PmeI6SacI3SalI3SmaI3HindIII3BstI8一般實驗指導手冊上都說質粒：片段＝1：3（摩爾比），在實際操作中我以

4、為在1：5甚至1：10為宜。做好“一、二”，16℃10小時后，每次都能有效地連接上。當然還有大腸桿菌感受覺態(tài)問題，我們以前自己做，現(xiàn)在懶得做了，都用“天為時代公司”的產(chǎn)品，感覺還不錯（特別聲明我不是天為公司內(nèi)線，呵呵）。這里介紹一個估測處DNA濃度的方法：DNA可以用紫外法檢測，也可以電泳對比marker估測，在要求不是很精確情況下，大家不妨試試下面方法：1取一平皿。2薄薄倒一層含有EB的瓊脂糖膠，凝固(4℃可以存一個星期)。3平皿背面