高效液相色譜法的計算方法

1、高效液相色譜法的計算方法高效液相色譜法的計算方法高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后，依次進(jìn)入檢測器，色譜信號由記錄儀或積分儀記錄。1、對儀器的一般要求所用的儀器為高效液相色譜儀。色譜柱的填料和流動相的組分應(yīng)按各品種項下的規(guī)定。常用的色譜柱填料有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基

2、鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料，用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用于分子排阻色譜等。注樣量一般為數(shù)微升。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。在用紫外吸收檢測器時，所用流動相應(yīng)符合紫外分光光度法（附錄ⅣA）項下對溶劑的要求。正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢

3、測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。2、系統(tǒng)適用性試驗按各品種項下要求對儀器進(jìn)行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)行試驗和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度和拖尾因子。(1)色譜柱的理論板數(shù)(N，用于定量表示色譜柱的分離效率，簡稱柱效)。在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)

4、物質(zhì)峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應(yīng)取相同單位）和半高峰寬(Wh2)，按n＝5.54(tRWh2)2計算色譜柱的理論板數(shù)，如果測得理論板數(shù)低于各品種項下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。如果色譜圖Ⅰ中沒有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標(biāo)峰保留時間相同的雜質(zhì)峰，則色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰面積之和應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積（溶劑峰不計在內(nèi)）。如果色譜圖Ⅰ中有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰保留時間

5、相同的雜質(zhì)峰，應(yīng)將色譜圖Ⅱ上的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積減去色譜圖Ⅰ中此雜質(zhì)峰面積，即為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積；色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰總面積加色譜圖Ⅰ中此雜峰面積，即為各雜質(zhì)峰的校正總面積，各雜質(zhì)峰的校正總面積應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積。(3)內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中某個雜質(zhì)或主成分含量按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰

6、面積或峰高。按下式計算校正因子：f＝(AsCs)(ArCr)。式中As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；Ar為對照品的峰面積或峰高；Cs為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；Cr為對照品的濃度。再取各品種項下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品（或其雜質(zhì)）峰和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高。按下式計算含量：Cx＝Ax(A’sC’s)f式中Ax為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高；Cx為供試品（或其雜質(zhì)）溶液的濃度；A’s為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；C’