大腹園蛛組織蛋白酶B相關(guān)cDNA Avg1克隆及表達(dá)研究.pdf

1、從構(gòu)建的大腹園蛛主壺腹腺cDNA文庫中篩選到Avg1(基因登錄號為AY302573)完整cDNA克隆,為一新的CB相關(guān)基因.CB為溶酶體內(nèi)一種重要的半胱氨酸內(nèi)切蛋白水解酶,具有廣譜的蛋白酶活性,參與機體多種腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移等多種生理和病理過程,因此越來越受到人們的廣泛關(guān)注.該實驗根據(jù)Avg1cDNA序列特點,設(shè)計合成引物(AvgS,AvgX),提取大腹園蛛主壺腹腺總RNA并以此為模板,RT-PCR方法擴增Avg1cDNA去除信號肽的部分

2、序列(Avg),將目的片段Avg與原核表達(dá)載體pET-28a(+),pET-20b(+)分別用EcoR I,Nco I酶切處理,回收純化后,連接構(gòu)建兩個重組載體,轉(zhuǎn)化克隆宿主菌Ecoli DH5a中,經(jīng)酶切及PCR鑒定為陽性克隆后進(jìn)一步測序鑒定,結(jié)果堿基、預(yù)測氨基酸序列均與Avg1(去除信號肽)100﹪一致,并具有正確的讀碼框,獲得的重組質(zhì)粒Avg-28a、Avg-20b可以用于下步表達(dá).大量提取重組質(zhì)粒Avg-28a、Avg-20b,

3、將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌Ecoli BL21(DE3)中,鑒定為陽性克隆后,用IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳分析,Avg-28a-DE3在近36kDa處出現(xiàn)了明顯的表達(dá)帶,其大小與預(yù)計分子量(35459.13Da)相當(dāng),經(jīng)薄層掃描表達(dá)外源蛋白量占全菌體蛋白總量的39.6﹪,且表達(dá)形式主要為包涵體,將表達(dá)的包涵體蛋白進(jìn)行變性、復(fù)性處理后測定蛋白酶活性,未見明顯的酶活性;而Avg-20b-DE3未出現(xiàn)明顯的表達(dá)帶,用RT-PCR