化學發(fā)光法的原理技術要點及評價應用

1、化學發(fā)光免疫技術,第一節(jié) 發(fā)光與化學發(fā)光劑第二節(jié) 發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）（chemiluminescence enzyme immunoasssay） 第三節(jié) 化學發(fā)光免疫測定技術(CLIA)（chemiluminescence immunoassay） 第四章 電化學發(fā)光免疫測定技術(ECLI)(electrochemiluminescence immunoassay),化學發(fā)光免疫技術：集靈敏的化學 發(fā)

2、光分析和特異的抗原抗體免疫測 定于一體的檢測技術。,概 念,特點： 特異性高、敏感性高、分離簡便、 快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、 可自動化。,化學發(fā)光免疫技術的類型,按發(fā)光劑不同分為 1.發(fā)光酶免疫測定（CLEIA） chemiluminescence enzymeimmunoasssay 2.化學發(fā)光免疫測定技術(CLIA) chemiluminescence immunoassay 3.電化學發(fā)光

3、免疫測定技術(ECLI) electrochemiluminescence immunoassay 按分離方法不同分 1.微粒子化學發(fā)光免疫測定 2.磁顆粒化學發(fā)光免疫測定,第一節(jié) 發(fā)光與化學發(fā)光劑,一、發(fā)光 一種物質由電子激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時， 釋放出的能量表現為光的發(fā)射。,1.光照發(fā)光:發(fā)光劑經短波長入射光照射后進入激 發(fā)態(tài)，當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。,2.生物發(fā)光:反應底物在熒光素酶的催化下利用

4、ATP產能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回 復到基態(tài)時多余的能量以光子形式放出。,3.化學發(fā)光:在常溫下由化學反應產生的光的發(fā)射。 化學發(fā)光是一個多步驟的過程。,,熒光素酶ATP；O2；Mg2+,,,氧化螢火蟲熒光素,螢火蟲熒光素,生物發(fā)光,返回,,,,,,,光 + AMP+ O2 + CO2 +,化學發(fā)光,機制：某些化合物可以利用化學反應產生的能 量使其產物分子或反應中間態(tài)分子上升至電子 激發(fā)態(tài)。當此產物分子或中間態(tài)分

5、子衰退至基 態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光）。,二、化學發(fā)光劑,化學發(fā)光劑或發(fā)光底物：在化學發(fā)光反應中參 與能量轉移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量 的化合物。 發(fā)光劑分為熒光素、生物發(fā)光劑、化學發(fā)光劑,①能參與化學發(fā)光反應； ②與抗原或抗體偶聯后形成穩(wěn)定的結合物試劑； ③偶聯后仍保留高的量子效應和反應動力； ④應不改變或極少改變被標記物的理化特性， 特別是免疫活性。,化學發(fā)光劑應符合以下幾個條件,返回,1.酶

6、促反應的發(fā)光底物,是指經酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物。 CLEIA中常用的酶有HRP和AP HRP的發(fā)光底物有魯米諾、對-羥基苯乙酸 AP的發(fā)光底物有AMPPD、4-MUP（熒光底物） 特點：可作標記物、也可作過氧化物酶的底物,1.1 魯米諾,H2O2 /OH — HRP,,,,,,,,,,,,+N2 + H2O +光,對-羥基苯乙酸（HPA）,HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體（熒光 物質），

7、在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長 的熒光，可用熒光光度計測量。,1.2 HPA,H2O2HRP,,,,,,,,,,,+熒 光,,氧化二聚體,AMPPD,AMPPD在堿性條件下，被AP酶解生成相當穩(wěn)定的 AMP-D陰離子，其有2～30min的分解半衰期，發(fā) 出波長為470nm的持續(xù)性光，在15min時其強度 達到高峰，15～60min內光強度保持相對穩(wěn)定。,,,,,,,,,,,,光,AP /OH —

8、 HPO4 2—,,1.3 AMPPD,4-MUP,4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的 激發(fā)光的作用下，發(fā)出448nm的熒光，可用熒 光光度計進行測量。,,,,,,,,,,,,熒光,AP,1.4 4-MUP,4-MU,360nm激發(fā)光,,H3PO4 +,2.直接化學發(fā)光劑,特點：不需催化劑，只需改變溶液的pH等條件 就能發(fā)光的物質。反應迅速、背景低、 信比高，發(fā)光量

9、與AE濃度呈線性關系。 常用試劑：吖啶酯（acridinium，AE）,+ CO2+ 光,,3.電化學發(fā)光劑,是指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)出 光的物質。特點：①反應在電極進行； ②電子供體為：三丙胺（TPA） ③化學發(fā)光劑：三聯毗啶釕,返回,三聯毗啶釕分子結構圖,第二節(jié) 發(fā)光酶免疫測定（CLEIA）,一、原理 屬于酶免疫測定的一種。只是最后一 步酶反應所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應

10、 發(fā)出的光在特定的儀器上進行測定。,二、技術類型 根據酶促反應底物不同可分為： 1.熒光酶免疫測定技術 2.化學發(fā)光酶免疫測定技術,根據免疫學反應模式分 1.雙抗體夾心法和雙抗原夾心法 3.固相抗原競爭法：,熒光酶免疫測定技術反應原理圖,洗滌棄上清,,,,,是利用理想的酶熒光底物，生成的產物穩(wěn)定并有 強的熒光強度，通過測定熒光強度進行定量。,化學發(fā)光酶免疫測定技術反應原理圖,洗滌棄上清,,,,,

11、是利用酶對發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光， 通過光強度的測定而直接進行定量。,電化學發(fā)光原理圖,這一過程可在電極表面周而復始地進行 產生許多光子，使光信號增強,返回,激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定,基態(tài),電極,1.抗原抗體結合反應 將已包被了抗體的乳膠微 粒和待測標本加入反應杯中，經溫育一定時間 后,再加入AP標記抗體，溫育,形成固相包被抗 體-抗原-酶標抗體復合物,技術要點,2.分離技術 將復合物轉移到玻璃纖維上，用緩 沖液

12、洗滌，沒結合的抗原被洗脫，酶標抗體-抗 原-膠乳微?？贵w復合物則被保留在纖維膜上。,3.酶促發(fā)光反應 加入4-MUP，酶標抗體上AP將 4-MUP分解，形成4-MU，它在360nm激發(fā)光的照 射下，發(fā)出448nm的熒光，經熒光儀記錄，放大， 根據標準曲線由電腦計算出所測物質的含量,1.磁顆粒分離法：用抗原或抗體包被磁顆粒,與標 本中相應抗原或抗體和酶標的抗體或抗原通過 一定模式的免疫學反應后,最終通過磁場將結合

13、 酶標記物IC和游離酶標記物進行分離的技術。,分離技術,2.微粒子捕獲法：所用顆粒是無磁性微粒子作為 抗體或抗原的包被載體, 然后用纖維膜柱子進 行酶標記物的結合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離。,3.包被珠分離法：用聚苯乙稀等材料制成小珠,在 小珠上包被抗原或抗體,經抗原抗體反應后,將 結合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標記物進行分離.,第三節(jié) 化學發(fā)光免疫測定技術（CLIA）,一、原理 用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體,與 待測標

14、本中相應Ab或Ag、磁顆粒性的Ag或Ab反 應，通過磁場把結合狀態(tài)（沉淀部分）和游離 狀態(tài)的化學發(fā)光劑標記物分離開來，然后加入 發(fā)光促進劑進行發(fā)光反應，通過對發(fā)光強度的 檢測進行定量或定性檢測 。,二、技術類型 1.分離方法 常用磁顆粒分離技術 2.免疫學反應模式 同酶發(fā)光免疫測定技術 3.不同只是相應標記物是吖啶酯而不是酶,1.抗原抗體結合反應 將包被McAb的磁顆粒和待 測標本加入到反應管中

15、，標本中待測Ag與磁珠 上Ab結合，再加上AE標記Ab，經過溫育，形成 磁珠Ab-Ag-AE標記Ab復合物。,技術要點,2.分離技術 在電磁場中進行2-3次洗滌后，很快 地將未結合的多余Ag和標記Ab洗去。,3.化學發(fā)光反應 經洗滌的磁珠中，加入H2O2和 pH糾正液NaOH，這時AE不需要催化劑即分解并 發(fā)光，由集光器接收，經光電倍增管放大，記 錄1S內所產生的光子能，其積分與被測物含量 成正比，按標準曲

16、線，儀器可計算出被測物含量。,1.AE其低背景噪音、化學反應簡單、快速而無催 化劑。,方法評價,2.AE與大分子的結合并無減少所產生的光量， 從而增加靈敏度，靈敏度可達10-15g/ml。,3.AE標記試劑有效期長，可達一年。,4.固相分離劑為極為幼細的磁粉，除增大包被 面積，加快反應外，亦同時使清洗及分離更 簡易、快捷。,第四節(jié) 電化學發(fā)光免疫測定技術（ECLI）,一、原理 是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特

17、異性化學發(fā)光反應，實際上包括了電化學和化 學發(fā)光二個過程。ECL是電啟動發(fā)光反應，而CL 是通過化合物混合啟動發(fā)光反應。用化學發(fā)光 劑三聯吡啶釕[Ru(bpy)3]2+標記Ab，通過Ag-Ab 反應和磁珠分離技術，根據三聯吡啶釕在電極 上發(fā)出的光強度對待測的Ag或Ab進行定量/定性。,二、技術類型 1.分離方法 常用磁顆粒分離技術 2.免疫學反應模式 同酶發(fā)光免疫測定技術 3.相應標記物是三聯吡啶

18、釕而不是酶,1.三聯吡啶釕標記抗體和生物素標記抗體與待測標本 同時加入一個反應杯中孵育反應,技術要點,2.將鏈霉親和素（SA）包被磁珠加入反應杯中，再次 孵育，使生物素（B）通過與親和素（A）的結合， 將磁珠、Ab連接為一體，形成雙Ab夾心法。,3.蠕動泵將形成的 [Ru(bpy)3]2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠 復合體吸入流動測量室，磁珠被工作電極下面的磁鐵 吸附于電極表面。同時，游離的Ab也被

19、吸出測量室。,4.蠕動泵加入TPA，電極加電壓，啟動ECL反應過程。 該過程在電極表面周而復始地進行，產生許多光子， 光電倍增管檢測光強度，其與[Ru(bpy)3]2+的濃度呈 線性關系,故可測出待測Ag的含量。,原理圖,返回,抗體包被 樣本 Ru(byp)2+ TPA緩沖的磁珠 抗原 標記抗體

20、 液洗滌,3,方法評價,①標記物的再循環(huán)利用，使發(fā)光時間更長、強 度更高、易于測定；②敏感度高，可達pg／ml或pmol水平；③線性范圍寬＞104；④反應時間短，20min以內可完成測定；⑤試劑穩(wěn)定性好，2～5℃可保持一年以上。,五、臨床應用,1.甲狀腺激素 2.生殖激素3.腎上腺/垂體激素 4.貧血因子5.腫瘤標記物 6.感染