生物化學(xué)-核酸課件

1、第二章 核酸,核 酸(nucleic acid),是由核苷酸組成的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。,第一節(jié) 概述,核酸是一類重要的生物大分子，擔(dān)負著生命信息的儲存與傳遞。核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。,第一節(jié) 核酸是遺傳物質(zhì)的載體,一、核酸的研究發(fā)現(xiàn)史1868年，科學(xué)家從細胞核中分離得到一種酸性物質(zhì)，即現(xiàn)在被稱為核酸的物質(zhì)。,核酸的分類及分布,主要在細胞核,存在于胞核、胞液中。,

2、脫氧核糖核酸(DNA),核糖核酸(RNA),,生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),核酸的分類及分布,存在于細胞核和線粒體內(nèi)。,存在于胞核、胞液和線粒體。,攜帶遺傳信息，決定細胞和個體的遺傳型(genotype)。,參與遺傳信息的復(fù)制與表達。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。,RNA的分類和功能,信使RNA（mRNA） 攜帶DNA遺傳信息轉(zhuǎn)運RNA（tRNA） 通過反密碼子識別mRNA的

3、 密碼子，使氨基酸對號入座核蛋白體 (rRNA) 與核糖體蛋白形成核糖體， 是蛋白質(zhì)合成的場所,,98％核中（染色體中） 真核 線粒體（mDNA） 核外 葉綠體（ctDNA）DNA 擬核

4、原核 核外：質(zhì)粒（plasmid） 病毒：DNA病毒,二、核酸的種類和分布,核酸分為兩大類： 脫氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid （DNA） 核糖核酸 Ribonucleic Acid（RNA）,第二節(jié)核酸的分子組成,,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,堿基,戊糖,,元素組成： C H O N P,核酸完全水解產(chǎn)生嘌呤和嘧啶等堿性物質(zhì)、戊糖

5、（核糖或脫氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解則產(chǎn)生核苷和核苷酸。每個核苷分子含一分子堿基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除產(chǎn)生核苷外，還有一分子磷酸。核酸的各種水解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離鑒定。,核酸的基本組成單位是核苷酸,堿基,戊糖,磷酸,核苷酸,核苷,,,,,核酸,,,,,,DNA的基本組成單位是脫氧核糖核苷酸 。RNA的基本組成單位是核糖核苷酸 。,嘌呤,嘧啶,堿基,腺嘌呤（A）,鳥嘌呤（G）,胞嘧啶（C）,胸腺嘧啶（

6、T）,尿嘧啶（U）,,,,,DNA、RNA均有,DNA有,RNA有,,,核苷酸的結(jié)構(gòu),每種核酸都含有四種堿基 。,戊 糖,（構(gòu)成RNA）,核糖,（構(gòu)成DNA）,脫氧核糖,嘌呤,,,腺嘌呤(adenine, A),鳥嘌呤(guanine, G),堿 基,,,,嘧啶,胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),,核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲

7、基化產(chǎn)物。,核苷（或脫氧核苷）：堿基和核糖（或脫氧核糖）通過糖苷鍵連接形成。,糖苷鍵,,,,核苷酸：AMP, GMP, UMP, CMP脫氧核苷酸：dAMP, dGMP, dTMP, dCMP,核苷酸（脫氧核苷酸）：核苷（脫氧核苷）和磷酸以酯鍵連接形成。,多磷酸核苷酸： NMP，NDP，NTP,環(huán)化核苷酸: cAMP，cGMP,肌苷酸及鳥苷酸(強力味精),輔酶 NAD、NADP、FMN,,IMP

8、 GMP,多聚核苷酸（核酸）,多聚核苷酸是通過一個核苷酸的C3’-OH 與另一分子核苷酸的5’-磷酸基形成3’,5’-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。,5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3′-羥基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸鏈具有方向性，當表示一個多聚核苷酸鏈時，必須注明它的方向是5′→3′或是3′→5′。,多聚核苷酸的表示方式,DNA

9、 RNA,5′PdAPdCPdGPdTOH 3′ 5′PAPCPGPUOH ′ 或5′ACGTGCGT 3′ 5′ACGUAUGU 3′ ACGTGCGT

10、 ACGUAUGU,DNA的合成原料： dATP, dGTP, dCTP, dTTP. RNA的合成原料： ATP, GTP, CTP, TTP.,第二節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu),一、DNA的一級結(jié)構(gòu)脫氧核糖核酸的排列順序可以用堿基排列順序表示連接鍵：3’，5’-磷酸二酯鍵磷酸與戊糖順序相連形成主鏈骨架堿基形成側(cè)鏈多核苷酸鏈均有5’-末端和3’-末端

11、 DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。,2. 基因與基因組,基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物細胞中DNA分子的最小功能單位（交換單位）。,基因組（genome）：某生物體（完整單倍體）所含全部遺傳物質(zhì)的總和。包括：核基因組（擬核/核DNA）及核外（質(zhì)粒/質(zhì)體DNA）,各種細胞、病毒和細菌質(zhì)粒中基因組的大小,3. 原核生物基因組特點

12、 重復(fù)序列少，多位編碼區(qū) 多為操縱子形式組織 有重疊基因存在,真核生物基因組特點 以染色體存在 重復(fù)序列多,基因組計劃人類基因組計劃（Human Genome Project， HGP ）酵母基因組計劃 （YGP）大腸桿菌（E.Coli）,二、DNA的二級結(jié)構(gòu) DNA的雙螺旋模型,1953年，J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)DNA結(jié)晶的X-衍射圖譜和

13、分子模型，提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，并對模型的生物學(xué)意義作出了科學(xué)的解釋和預(yù)測。在DNA分子中，嘌呤堿基的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù)相等。,DNA雙螺旋模型要點,B型結(jié)構(gòu) 兩條鏈反向平行，右手螺旋 堿基在內(nèi)（A＝T，G≡C）堿基平面垂直于螺旋軸 戊糖在外，雙螺旋每轉(zhuǎn)一周 為10堿基對（bp）A型結(jié)構(gòu) 堿基平面傾斜20º，螺旋變粗變短，螺距2～3nm。Z型結(jié)構(gòu) 左手螺旋，只有小溝,

14、,雙螺旋DNA的結(jié)構(gòu)參數(shù),雙螺旋穩(wěn)定的力 氫鍵 堿基堆積力（疏水相互作用及范德華力） 離子鍵等 則DNA變性劑（熱、pH、脲/酰胺、有機溶劑）,DNA的存在形式,二、DNA的三級結(jié)構(gòu),DNA雙螺旋的進一步扭曲構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)，負超螺旋 原核 雙鏈環(huán)狀DNA（dcDNA） 病毒 單鏈環(huán)狀DNA（scDNA） 單鏈線性DNA（ssDNA）,真核 雙鏈線性DNA（d

15、sDNA）,第四節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)與功能,一、結(jié)構(gòu)特點堿基組成 A、G、C、U （A＝U/G≡C） 稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解多為單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成螺旋分子較小分類mRNA（hnRNA 核不均一RNA）tRNA rRNA （snRNA/asRNA）少數(shù)RNA病毒,二、tRNA,占RNA總量的15％一種氨基酸對應(yīng)最少一種RNA,分子量25000左右，大約由70－90個核苷酸組成，沉降系數(shù)為4S左

16、右。分子中含有較多的修飾成分。3'-末端都具有CpCpAOH的結(jié)構(gòu)。,tRNA的三級結(jié)構(gòu),三、rRNA,占RNA總量的80％,,,四、mRNA和hnRNA,占細胞總RNA的3％～5％,真核細胞mRNA的3‘-末端有一段長達200個核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，稱為 “尾結(jié)構(gòu)” ，5’ -末端有一個甲基化的鳥苷酸，稱為” 帽結(jié)構(gòu)“ 。,五、snRNA （small nucleic RNA 核小RNA）

17、 scRNA （small cytoplasmic RNA） asRNA （antisense RNA）,第四節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu),一，DNA的分子結(jié)構(gòu) （一）DNA的一級結(jié)構(gòu)： 定義核酸中核苷酸的排列順序。由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列。,核苷酸之間以3 ?, 5 ? -磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。,→,書寫方法,,DNA 與RNA的區(qū)別,（二） DNA的二

18、級結(jié)構(gòu) ——雙螺旋結(jié)構(gòu),DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點,1.兩條鏈反向，平行，堿基互補[A] = [T] [G] [C] 。 2.圍繞同一中心軸構(gòu)成右手雙螺旋 。螺旋直徑2nm，表面有大溝和小溝（蛋白質(zhì)結(jié)合部位）。3. 堿基在內(nèi)側(cè)。每圈螺旋含10個堿基對 (bp)，螺距為3.4nm。,4. 維持雙螺旋穩(wěn)定的因素：橫向為氫鍵，縱向為堿基間的堆積力。,堿基互補配對,T,A,G,C,（一）原核生物DNA的高

19、級結(jié)構(gòu),（三）DNA的三級結(jié)構(gòu),,（二）真核生物DNA的高級結(jié)構(gòu),真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其基本單位是 核小體。,核小體的組成DNA：約200bp 組蛋白：H1H2A，H2BH3H4,八聚體,DNA的功能：基因是DNA分子中的某一段核苷酸排列順序，編碼特定的蛋白質(zhì)。,二、RNA的種類和分子結(jié)構(gòu),RNA的一級結(jié)構(gòu)：多核糖核苷酸鏈中核苷酸的排列順序RNA為一條多核苷酸鏈，有的堿基配對，有的不配對，可以螺旋，

20、也可以不螺旋。RNA通常以單鏈形式存在，局部可有二、三級結(jié)構(gòu),動物細胞內(nèi)主要RNA的種類及功能,,,,核蛋白體,RNA,信使,RNA,轉(zhuǎn)運,RNA,功,能,核蛋白體組分,蛋白質(zhì)合成模板,轉(zhuǎn)運氨基酸,,,核蛋白體,RNA,信使,RNA,轉(zhuǎn)運,RNA,細胞核和胞液,功,能,rRNA,mRNA,tRNA,核蛋白體組分,二、RNA的種類和分子結(jié)構(gòu),核蛋白體,RNA,（一 ）信使RNA,,內(nèi)含子(intron),* mRNA成熟過程,外顯子

21、(exon),mRNA的功能：作為蛋白質(zhì)合成的模板。,* mRNA結(jié)構(gòu)特點,1. 大多數(shù)真核mRNA的5´末端形成帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-。,2. 大多數(shù)真核mRNA的3´末端有多聚A尾。,* tRNA的一級結(jié)構(gòu)特點 含稀有堿基較多 3´末端為 — CCA-OH 5´末端大多數(shù)為G 由70~90個核苷酸組成,（二）轉(zhuǎn)運RNA,* tRNA的功能選擇性搬運氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)

22、的翻譯。,* tRNA的二級結(jié)構(gòu)——三葉草形,氨基酸臂,額外環(huán),,* tRNA的三級結(jié)構(gòu)—— 倒L形,* rRNA的結(jié)構(gòu),（三）核蛋白體RNA,* rRNA的功能參與組成核蛋白體（ rRNA+pr） ，作為蛋白質(zhì)生物合成的場所。核蛋白體包括大亞基和小亞基,核酸的理化性質(zhì),第 三 節(jié),一、紫外吸收,在260nm波長有最大吸收峰，是由堿基的共軛雙鍵決定的。這一特性常用作核酸的定性、定量分析。,二、核酸的紫外吸收特性,在核酸分子中，由

23、于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)。以A260/A280進行定性、定量DNA和RNA溶液中加入溴化乙錠（EB），在紫外下發(fā)出熒光,三、核酸的變性、復(fù)性與分子雜交,1. 變性穩(wěn)定核酸雙螺旋次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。核酸的的一級結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。變性表征 生物活性部分喪失、粘度下降、浮力密度升高、

24、紫外吸收增加（增色效應(yīng)）變性因素： pH（>11.3或<5.0） 變性劑（脲、甲酰胺、甲醛） 低離子強度 加熱,二、DNA的變性,定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。,變性因素：過量酸，堿，加熱等。,,DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂,DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常將紫外吸收的增加量達最大量一半時的溫度稱熔解溫度，用Tm表示。一

25、般DNA的Tm值在70-85?C之間。DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關(guān)。G和C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通過經(jīng)驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,2. 熱變性和Tm,例：變性引起紫外吸收值的改變,DNA的紫外吸收光譜,增色效應(yīng)：DNA變性時其溶液OD260增高的現(xiàn)象。,Tm：DNA 解鏈50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(Tm)。其大小與G+C含量成

26、正比。,三、DNA的復(fù)性,DNA復(fù)性的定義在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。,減色效應(yīng)DNA復(fù)性時，其溶液OD260降低。,熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火。,3. 核酸的復(fù)性,變性核酸的互補鏈在適當?shù)臈l件下，重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性。DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)，具有減色效應(yīng)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫

27、時，DNA不可能復(fù)性。變性的DNA緩慢冷卻時可復(fù)性，因此又稱為“退火”。 退火溫度＝Tm－25℃復(fù)性影響因素 片段濃度/片段大小/片段復(fù)雜性（重復(fù)序列數(shù)目）/ 溶液離子強度,4.分子雜交,DNA單鏈與在某些區(qū)域有互補序列的異源DNA單鏈或RNA鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。Southern 雜交（Southern bolting）N

28、orthern 雜交（Northern bolting）Western 雜交 （Western bolting）,四、核酸的序列測定,雙脫氧鏈終止法（Sanger酶法）2. Gilbert化學(xué)降解法,本 章 小 結(jié),核酸是遺傳物質(zhì)載體的證明和研究歷史核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)：戊糖、堿基（A、T、G、C、U），核苷、核苷酸及其衍生物的結(jié)構(gòu)特點（原子編號）DNA的結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)（核酸序列及其表示、基因及基因組、序列測定）、二級結(jié)構(gòu)（