臨床雞源致病性耐藥空腸彎曲桿菌的基因組學(xué)研究.pdf

1、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)是一種在世界范圍內(nèi)引起人類胃腸炎的主要食源性致病菌，嚴(yán)重感染時(shí)也可能引起格林-巴利綜合癥、米歇爾綜合征和菌血癥。隨著近年越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，空腸彎曲桿菌的耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，由空腸彎曲桿菌感染引起的人類及動(dòng)物性疾病也越來(lái)越多。為了更有效的預(yù)防和控制耐藥空腸彎曲桿菌以及由其引發(fā)疾病的產(chǎn)生，必須了解清楚致病性耐藥菌的產(chǎn)生原因及其耐藥和毒性的產(chǎn)生機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室前期在臨床上采集了疑似空腸彎曲

2、桿菌樣本，本實(shí)驗(yàn)以6株雞源菌株為研究對(duì)象，通過(guò)耐藥表型和毒力表型試驗(yàn)篩選出了一株具有多重耐藥且致病性相對(duì)較強(qiáng)的菌株(編號(hào)為1655)，并通過(guò)全基因組從頭測(cè)序技術(shù)，運(yùn)用分子生物學(xué)手段對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行基因組特征、耐藥機(jī)制及致病機(jī)制的分析，并試圖闡明耐藥和毒力之間的關(guān)系。本課題在一定程度上解釋了臨床致病性耐藥空腸彎曲桿菌的發(fā)生機(jī)理，并為生物信息庫(kù)提供了有利數(shù)據(jù)，同時(shí)為防止彎曲桿菌耐藥性和致病性的產(chǎn)生和傳播提供了理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。
　

3、　1.臨床疑似空腸彎曲菌菌株的PCR鑒定和MIC測(cè)定
　　將實(shí)驗(yàn)室之前用甘油保存于-80℃的6株疑似空腸彎曲桿菌的菌株(編號(hào)分別為1442、1447、1614、1622、1655和1685)以及RM1221和ATCC33560進(jìn)行復(fù)蘇。用微量移液槍取出50μL涂布于預(yù)先準(zhǔn)備好的改良Skirrow氏血平板上，接種好后置42℃微需氧孵育24-48h左右，觀察菌落形態(tài)，然后挑取單菌落于MH肉湯中傳代兩次。提取細(xì)菌基因組DNA，根據(jù)查閱文

4、獻(xiàn)設(shè)計(jì)鑒定空腸彎曲桿菌的兩對(duì)引物16S和mapA，對(duì)復(fù)蘇的疑似菌株進(jìn)行PCR鑒定，兩對(duì)引物的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別是857bp和589bp，經(jīng)PCR鑒定以及測(cè)序分析，最終確定6株疑似菌株均為空腸彎曲桿菌。
　　采用瓊脂稀釋法進(jìn)行6株菌的藥物敏感性試驗(yàn)，以ATCC33560作質(zhì)控。主要關(guān)注常用于空腸彎曲桿菌病治療的四大類藥物，分別是氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氨基糖苷類。選取這四大類藥物的8種代表藥測(cè)定MIC。結(jié)果顯示:6株菌對(duì)這8

5、種藥物均產(chǎn)生了耐藥性，可見(jiàn)臨床菌株的耐藥現(xiàn)象還是非常嚴(yán)重的。
　　2.臨床空腸彎曲菌的體內(nèi)毒性試驗(yàn)以及LD50的測(cè)定
　　以預(yù)試劑量1×109CFU/mL（通過(guò)計(jì)數(shù)得到）的菌液1mL采用腹腔注射感染雛雞，1442、1622和1655組在24h內(nèi)都出現(xiàn)了不同程度的死亡，其中以1655組最為嚴(yán)重，因此，初步篩選這3株菌進(jìn)行LD50的測(cè)定，方法為改良寇氏法。
　　結(jié)果顯示:以濃度3.7×108CFU/mL菌液1mL口服感染2

6、日齡的健康雛雞，感染兩周后1442和1622組只有高濃度組出現(xiàn)了1-2只的死亡，因此無(wú)法計(jì)算LD50，而1655組在不同濃度出現(xiàn)了不同的死亡率，計(jì)算出的LD50為8.45×107CFU/mL。以同樣濃度和劑量對(duì)2日齡的健康雛雞進(jìn)行腹腔注射感染，雖然1442組和1622組在不同濃度下出現(xiàn)了不同的死亡率，但1655組在最低濃度3.7×105CFU/mL下也出現(xiàn)了100％的死亡率。結(jié)合口服感染的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明1655菌株具有相當(dāng)強(qiáng)的毒力。同樣

7、再以3.1×108CFU/mL的劑量腹腔注射感染16日齡的小雞，1442和1622組基本沒(méi)出現(xiàn)死亡，但1655組出現(xiàn)了相當(dāng)高的死亡率，LD50為1.60×107CFU/mL。因此，初步斷定1655菌株具有一定的致病性。
　　3.細(xì)菌黏附、侵襲以及胞外生存能力的考察
　　LD50的測(cè)定考察了菌株的體內(nèi)毒性情況，還需對(duì)菌株的體外毒性進(jìn)行檢測(cè)，包括檢測(cè)菌株對(duì)細(xì)胞的侵襲和黏附能力，以及菌株在體外的生存活力。選用RAW264.7細(xì)胞，

8、采用慶大霉素保護(hù)法對(duì)初篩的1442、1622以及1655菌株進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，RM1221作為參照菌。結(jié)果顯示:3株臨床菌株的黏附和侵襲能力與RM1221相比都有顯著性差異。但就3株臨床菌而言，它們之間的黏附和侵襲能力沒(méi)有顯著差異，結(jié)合胞內(nèi)生存能力實(shí)驗(yàn)，1442可以存活至48h，而1622和1655可以存活至72h，并且可以明顯看出，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，1655菌株的侵襲數(shù)還是明顯比1622高，可能這也是它表現(xiàn)出比其它兩株菌毒性更強(qiáng)的原因。因此后

9、續(xù)試驗(yàn)將1655菌株作為重點(diǎn)研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序分析相關(guān)耐藥和毒性機(jī)制。
　　4.全基因組從頭測(cè)序-De novo測(cè)序
　　用試劑盒提取靶菌1655的基因組，樣品送自公司進(jìn)行質(zhì)檢、文庫(kù)構(gòu)建以及質(zhì)控等工作，然后上機(jī)測(cè)序，選定的測(cè)序方法為Solexa，本測(cè)序?qū)嶒?yàn)要求為雙端測(cè)序，讀長(zhǎng)為100nt，構(gòu)建一個(gè)隨機(jī)文庫(kù)。測(cè)序完成后進(jìn)行Contig的拼接、基因組環(huán)狀草圖的完成、基因組的預(yù)測(cè)以及注釋等工作，然后運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)

10、測(cè)序結(jié)果進(jìn)行耐藥和毒性機(jī)制的分析。結(jié)果顯示:1655菌株存在已報(bào)道的引起這四類藥物高水平耐藥的機(jī)制，如引起氟喹諾酮類藥物高水平耐藥的gyrA基因上的Thr-86-Ile位點(diǎn)的突變，大環(huán)內(nèi)酯類23SrRNA上A2075G位點(diǎn)的突變，介導(dǎo)四環(huán)素和氨基糖苷類耐藥的tetO外源基因的獲得以及導(dǎo)致氨基糖苷類耐藥aph-A和aadE基因的存在。并且預(yù)測(cè)到了一個(gè)編碼未知功能蛋白質(zhì)的基因位于質(zhì)粒pCG8245上，此質(zhì)粒為一個(gè)抗性質(zhì)粒，對(duì)于其編碼的未知功

11、能的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究，或許可以發(fā)現(xiàn)新的耐藥機(jī)制。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些之前沒(méi)有報(bào)道過(guò)的突變和缺失，或許與菌株的多重耐藥有關(guān)。對(duì)毒性機(jī)制的分析結(jié)果:基因序列分析表明，1655菌株除了攜帶對(duì)致病性產(chǎn)生作用的毒力因子外，沒(méi)有注釋到編碼毒力基因的噬菌體、毒力島以及與Ⅳ型分泌系統(tǒng)同源的基因，但已知的致病因素（比如，攜帶的毒力因子）或許可以解釋它的致病性;比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了大量的SNPs;通過(guò)與參考基因組RM1221、11168以及81-176

12、的共線性分析發(fā)現(xiàn)1655菌株基因組存在嚴(yán)重的缺失、重排以及倒位現(xiàn)象（包括內(nèi)部編碼和基因間區(qū)域），這表明適度的遺傳變化可能使1655的毒力增強(qiáng)。此外，在1655菌株染色體上存在的與毒性相關(guān)的可變基因區(qū)、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、鐵攝取系統(tǒng)以及發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒pTet可能都參與了菌株的毒性機(jī)制。分析結(jié)果還顯示，菌株間的基本基因內(nèi)容存在差異，這也為后續(xù)的分析提供了新的視角。另外還預(yù)測(cè)到了一些未知功能的蛋白質(zhì)、發(fā)生突變?nèi)笔У男蛄幸约芭c對(duì)照菌株有差異的生物學(xué)成分

13、，這些基因的共同作用或許會(huì)對(duì)細(xì)菌的耐藥和毒力產(chǎn)生影響。鑒于臨床分離株復(fù)雜的環(huán)境背景，導(dǎo)致其產(chǎn)生致病性的原因也比較復(fù)，因此僅從基因組內(nèi)容和結(jié)構(gòu)差異上進(jìn)行分析不夠全面，有些機(jī)制無(wú)法解釋清楚。
　　綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)一系列耐藥和毒性實(shí)驗(yàn)成功篩選出了一株具有致病性的多重耐藥菌株，并通過(guò)全基因組測(cè)序的方法，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了深入分析，闡明了臨床菌株產(chǎn)生多重耐藥以及致病性的原因，對(duì)于其復(fù)雜的耐藥和致病機(jī)制也進(jìn)行了初步分析，