轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和動(dòng)物克隆

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和動(dòng)物克隆,一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（概念、研究、問(wèn)題）二、轉(zhuǎn)基因的“動(dòng)物藥廠”三、抗感染動(dòng)物四、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)路線中的轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞五、基因敲除的小鼠模型（概念、方法、特點(diǎn)、應(yīng)用）六、克隆羊和動(dòng)物克?。ǜ拍睢⒁饬x）七、克隆人,,,,世界首只轉(zhuǎn)基因靈長(zhǎng)類動(dòng)物 ——-安迪,世界第一只轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,,一、什么是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指用實(shí)驗(yàn)導(dǎo)入的方法將外源基因在染色體基因內(nèi)穩(wěn)定整合并能穩(wěn)定表達(dá)的一類

2、動(dòng)物。（包括基因敲除的動(dòng)物）,動(dòng)物基因工程的發(fā)展?fàn)顩r與趨勢(shì),動(dòng)物基因工程的實(shí)質(zhì)是改變動(dòng)物的遺傳組成，增加動(dòng)物的遺傳多樣性，賦予轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新的表型特征，使能夠更好地服務(wù)與人類社會(huì)。,1、從簡(jiǎn)單的顯微注射法向高效率的轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植方向發(fā)展 從轉(zhuǎn)基因的技術(shù)手段來(lái)看，除DNA顯微注射法外，人們先后試過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)法、精子介導(dǎo)法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法和核移植法等多種轉(zhuǎn)基因方法。 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的核移植技術(shù)

3、已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的主流方法。,2、從外源基因隨機(jī)插入（或整合）到定點(diǎn)整合的轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)基因在基因組中的存在方式有兩種，即隨機(jī)整合和定點(diǎn)整合。,為了達(dá)到外源基因的高效表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)上增加了含有位點(diǎn)控制區(qū)（LCR）、核基質(zhì)附著區(qū)(MAR)等調(diào)控元件，可以實(shí)現(xiàn)插入位點(diǎn)非依賴性、拷貝數(shù)相關(guān)的表達(dá)模式。LCR和MAR的功能不受種屬差異的限制，無(wú)論外源基因插入什么位點(diǎn)，都能夠維持一個(gè)開(kāi)放的染色體結(jié)構(gòu)，有利于基因的表達(dá)。 基因打靶

4、技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因的定位操作。,從轉(zhuǎn)基因的策略來(lái)看，動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了兩個(gè)階段：第一階段為傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物階段，第二階段為條件性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物階段?！　　〗柚D(zhuǎn)基因技術(shù)可將單一的功能基因和基因簇引入高等動(dòng)物的基因組，或?qū)⒛康幕驈膭?dòng)物基因組中敲除，實(shí)現(xiàn)了種系內(nèi)和種系間基因轉(zhuǎn)移或修飾，產(chǎn)生新的基因型和表型?！　?目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要應(yīng)用在生物學(xué)基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)疾病模型、動(dòng)物生物反應(yīng)器、異種器官移植、動(dòng)物遺傳改良等５

5、個(gè)方面。,３、從傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因到條件控制的轉(zhuǎn)變,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)路線,經(jīng)典的技術(shù)路線  目的基因 顯微注射 已交配的 取出 移植 受體動(dòng)物 妊娠供體動(dòng)物 受精卵 輸卵管 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 缺

6、點(diǎn)：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低。,,,,,整合胚胎移植的技術(shù)路線 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 受體動(dòng)物子宮 目的基因 非手術(shù)

7、 胚胎移植  體外受精 體外培養(yǎng) 多細(xì)胞胚胎 檢測(cè) 整合外源基因卵子 受精卵 或囊胚 的胚胎精子優(yōu)點(diǎn)：受精卵的成活率高達(dá)90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率。,,,,,,,核移植（克?。┑募?/p>

8、術(shù)路線 目的基因 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物  導(dǎo)入 . 動(dòng)物胎兒成纖維細(xì)胞 妊娠

9、 取核 動(dòng)物 去核 重組的 體外培養(yǎng) 囊胚期 胚胎移植 卵細(xì)胞 受精卵 胚胎 受體動(dòng)物子宮,,,,,,,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的主要步驟,獲取外源目的基因外源目的基因與專性基因表達(dá)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、報(bào)告基因等構(gòu)件的拼接重組。外源重組目的基因?qū)肷臣?xì)胞或胚胎干細(xì)胞選擇攜帶目的基因的細(xì)胞，選擇體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物

10、轉(zhuǎn)基因胚胎的發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,一、轉(zhuǎn)移基因(一)轉(zhuǎn)移基因的原理：轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)在于各種生物的遺傳密碼都是統(tǒng)一的。都是以3個(gè)堿基決定一個(gè)氨基酸這樣的密碼形式貯存在DNA鏈上，各物種間形狀的不同僅僅是由于DNA上的四種核苷酸排列次序的不同，同時(shí)各種生物從DNA到蛋白質(zhì)合成都服從“中心法則”, 當(dāng)一個(gè)物種的細(xì)胞內(nèi)加入另一物種或人工合成的DNA(即基因)后就可能產(chǎn)生新的性狀。,(二)基因的獲得：取自現(xiàn)有的生物體如病毒、

11、細(xì)菌、體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的DNA,用限制內(nèi)切酶或外切酶把DNA切割成若干小段,然后再把這些小段利用連接酶分別放入載體中,并建成克隆載體。 基因的片斷可隨載體復(fù)制，有時(shí)亦可表達(dá)，用DNA 或抗體探針做分子雜交試驗(yàn)或ELISA試驗(yàn)篩選出帶有理想基因的克隆,再把理想基因載體放入大腸桿菌等宿主細(xì)胞中擴(kuò)大、增殖,或采用PCR的方法擴(kuò)增。再對(duì)擴(kuò)增的DNA片斷進(jìn)行適當(dāng)修飾,例如將一個(gè)單一的基因與經(jīng)選擇的啟動(dòng)子重組合，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)

12、移，或?qū)⑻囟ǖ目刂菩蛄羞B接到目的基因的結(jié)構(gòu)序列上，從而創(chuàng)造1個(gè)新的重組基因,然后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移。,理想基因也可用人工合成的辦法獲得，要合成一特定的基因，就是要合成具有一定排列順序的DNA，DNA上四種堿基的配對(duì)是非常嚴(yán)格的,腺嘌呤(A)必定和胸腺嘧啶(T) 配對(duì)，鳥(niǎo)嘌呤(G)必定和胞嘧啶(C)配對(duì)，由于蛋白質(zhì)合成不是直接以DNA作為模板,而是以DNA的副本mRNA作為模板，在RNA中，用尿嘧啶(U)代替了胸腺嘧啶(T)。,二、基因轉(zhuǎn)移的受體

13、細(xì)胞,(一)原生殖細(xì)胞：禽類的原生殖細(xì)胞容易分離、培養(yǎng)和冷凍，所以，這種受體細(xì)胞在禽類動(dòng)物較易實(shí)現(xiàn)。(二)配子：配子能把自身攜帶的基因組全部信息和外源插入基因序列，完整地貢獻(xiàn)給合子。由于精子可用作有效的轉(zhuǎn)移載體，所以，可以精子作為目的基因的受體。較多的是用重組病毒直接感染精子，精子即可把外源基因傳到合子。,(三)受精卵或胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)：精卵結(jié)合形成的單細(xì)胞受精卵，是最常用的外源基因轉(zhuǎn)移的受體；受精后的早期胚胎及囊胚期稍后的胚胎含有的內(nèi)細(xì)

14、胞團(tuán)，該細(xì)胞團(tuán)內(nèi)含有未分化的胚胎干細(xì)胞，也可認(rèn)為是全能的，或至少是多能性的，所以，用該時(shí)期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或囊胚期的細(xì)胞作為外源基因的受體細(xì)胞，也可望達(dá)到基因轉(zhuǎn)移的目的。但這種情況下制備的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物多為嵌合體。,三、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備主要敘述制備轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)程序。(一)不育雄性公鼠:結(jié)扎公鼠與母鼠交配以后產(chǎn)生假孕母鼠。受結(jié)扎的公鼠需8周以上，對(duì)種系無(wú)特殊要求。在正式實(shí)驗(yàn)前，結(jié)扎公鼠需與性成熟的雌性小鼠交配，反復(fù)交配兩次或三次，經(jīng)檢查雌體有

15、陰道栓，但均不懷孕產(chǎn)仔，則證明結(jié)扎成功。結(jié)扎公鼠使母鼠產(chǎn)生陰道栓的能力可維持2年。值得注意的是，如結(jié)扎公鼠與母鼠交配4～6 次均不能產(chǎn)生陰道栓，則該公鼠必須更換。,(二)假孕雌性母鼠:作為獲得外源基因即轉(zhuǎn)基因胚胎的養(yǎng)母，要求6周齡至5 個(gè)月較合適，對(duì)種系無(wú)特殊要求。其生殖系統(tǒng)的生理狀態(tài)應(yīng)與移進(jìn)胚胎的發(fā)育階段同步化，從而為移植胚胎提供著床和繼續(xù)發(fā)育的生理?xiàng)l件。將選好的成年健康雌性個(gè)體與不育雄性個(gè)體進(jìn)行交配，時(shí)間應(yīng)與供體(取受精卵的雌體)同

16、時(shí)進(jìn)行。一般為下午4點(diǎn)鐘合籠,次日晨選有陰道栓的待用。,(三)取受精卵的雌性母鼠：如果無(wú)特殊遺傳背景的要求，一般用雜交F1受精卵較為理想。因雜交F1代胚胎的發(fā)育能力和對(duì)外環(huán)境的耐受能力都較強(qiáng)，有益于提高移植胚胎的出生率。,在對(duì)遺傳背景有特殊要求的情況下，供卵母鼠需選擇種系，例如把一種鼠的等位基因轉(zhuǎn)移到另一種不同等位基因的種系，這種卵供體母鼠必須有特定的遺傳背景，因此需用純系鼠。在實(shí)際操作中，一般用4～6周母鼠作為超排卵供體，3～4周母

17、鼠產(chǎn)卵更多但卵細(xì)胞膜脆性較大，在處理過(guò)程中易破裂，而6周以后母鼠產(chǎn)卵逐漸減少。,四、基因?qū)氲姆椒?一)顯微注射法：在顯微鏡下，可借助顯微操作儀，將毛細(xì)玻璃管直接插入受精卵的雄原核中(較大的原核),注入特定的外源基因,即為基因顯微注射法。下面把利用顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因鼠的方法和步驟簡(jiǎn)述如下。,1. 超數(shù)排卵(超排)與取卵 (1)超數(shù)排卵：在雌性動(dòng)物發(fā)情周期的某一階段,用促性腺激素促使卵巢里大量卵泡成熟并排出，稱超數(shù)排卵。影響母鼠超排

18、因素有母鼠的性成熟程度、營(yíng)養(yǎng)、體重及母鼠種系。超排的最佳時(shí)間隨種系不同而異,一般在3～5周，超過(guò)6周超排卵數(shù)明顯減少。,在實(shí)際操作中常取4～6周齡的母鼠作超排卵供體，腹腔注射孕馬血清(PMS) 和人絨毛膜促性腺激素(hCG)誘導(dǎo)母鼠排卵。PMS模擬卵泡刺激素(FSH)作用，hCG模擬黃體生成素(LH)的作用。二者注射時(shí)間間隔為42～48h，排卵發(fā)生在注射hCG后10～13h,注射劑量為每鼠5～10u。為了實(shí)驗(yàn)方便，常在下午注射PMS，隔

19、日同一時(shí)間注射hCG，注射hCG 后每只母鼠置于一個(gè)單獨(dú)飼養(yǎng)的正常公鼠籠內(nèi)，次日晨檢查陰道栓。,(2)取卵：用頸椎脫臼法處死有陰道栓的雌鼠，把完整的輸卵管帶一小段子宮剪下,置于PBS平衡鹽溶液中，在解剖鏡下找出輸卵管傘部，用帶4號(hào)針頭的注射器將受精卵沖出，立即將卵子換至新鮮培養(yǎng)液內(nèi)洗滌3～4次即可用于顯微注射。,2. 注射外源DNA：顯微注射需用顯微操作儀，用來(lái)控制顯微持卵針和顯微注射針。持卵針是顯微注射時(shí)固定受精卵的細(xì)玻璃管，管口平滑

20、，通過(guò)一注射器控制持卵針，使其吸住要進(jìn)行注射的受精卵。用來(lái)注射外源DNA的細(xì)注射針管表面平滑，尖端鋒利,便于注射時(shí)穿過(guò)透明帶、細(xì)胞膜等。,取已制備好的受精卵細(xì)胞和外源DNA懸液,在倒置顯微鏡下做顯微注射。注射時(shí)先用持卵針吸住受精卵，再用注射針吸取外源DNA懸液,然后推動(dòng)注射針，使其刺入受精卵的雄原核，將DNA注入。注射完畢，慢慢抽出注射針,將受精卵放入新的培養(yǎng)液中，使其恢復(fù)。一般50～80％的受精卵在顯微注射后仍保持健康。（P120）,

21、3. 注射后受精卵(或胚胎)的移植：注射后單細(xì)胞至桑椹胚的卵(受精后0.5天到3.5天)移植至受孕后的0.5天的假孕鼠的輸卵管，輸卵管移植需用被透明帶包裹的卵。也可將注射有外源DNA的受精卵或桑椹胚體外培養(yǎng)至囊胚，再行移植。顯微注射后3.5天的囊胚移植至受孕后2.5天的假孕鼠子宮，子宮移植不需要有透明帶。,此法的優(yōu)點(diǎn)是，在一定設(shè)備和經(jīng)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)過(guò)程大為簡(jiǎn)化；任何DNA 順序都可直接導(dǎo)入原核內(nèi),導(dǎo)入的外源DNA在卵裂前與受體基因組整合

22、,其缺點(diǎn)在于導(dǎo)入的外源DNA通常以多拷貝串聯(lián)的形式隨機(jī)地整合于受體基因組中，妨礙其表達(dá)的正常調(diào)節(jié)。,(二)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：以逆轉(zhuǎn)錄病毒作載體， 把重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體DNA包裝成高滴度病毒顆粒，感染發(fā)育早期的胚胎，將外源基因?qū)胨拗鞯娜旧w內(nèi)的方法稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法。此法操作簡(jiǎn)單，可通過(guò)注射將重組病毒轉(zhuǎn)移到囊胚腔內(nèi)，也可將去透明帶的胚胎與分泌重組病毒顆粒的細(xì)胞共培養(yǎng)，以達(dá)到將外源DNA 轉(zhuǎn)移到胚胎中去的目的。,這一方法的優(yōu)點(diǎn)是，重組

23、逆轉(zhuǎn)錄病毒可同時(shí)感染大量胚胎。感染后的整合率高；外源DNA在受體細(xì)胞基因組中的整合通常是單拷貝的；不需要昂貴的顯微注射設(shè)備。本法的缺點(diǎn)是，由于選用的受體是早期胚胎，不是受精卵，致使外源DNA 在動(dòng)物各種組織中的分布不均,不易整合到生殖細(xì)胞中；由于病毒衣殼大小有限,限制了被導(dǎo)入的外源 DNA的大小，一般不超過(guò)15Kb。,(三)胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法：干細(xì)胞(Stem Cell)是一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體

24、的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱之為“萬(wàn)用細(xì)胞”。 干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。它包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。干細(xì)胞的發(fā)育受多種內(nèi)在機(jī)制和微環(huán)境因素的影響。,胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell,ES）：是胚胎發(fā)育期的胚細(xì)胞，可以人工培養(yǎng)增殖并具有分化成其它類型細(xì)胞的功能。,ES細(xì)胞的全能性指ES細(xì)胞在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的發(fā)育潛力，即ES細(xì)胞具有發(fā)育成完整動(dòng)物體的能力，可以為細(xì)胞的遺傳操

25、作和細(xì)胞分化研究提供豐富的試驗(yàn)材料。,ES細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征 ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核大，有一個(gè)或幾個(gè)核仁，胞核中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)胞漿少，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞排列緊密，呈集落狀生長(zhǎng)。用堿性磷酸酶染色，ES細(xì)胞呈棕紅色，而周圍的成纖維細(xì)胞呈淡黃色。,,,,,細(xì)胞克隆和周圍存在明顯界限，形成的克隆細(xì)胞彼此界限不清，細(xì)胞表面有折光較強(qiáng)的脂狀小滴。細(xì)胞克隆形態(tài)多樣，多數(shù)呈島狀或巢狀。小鼠ES細(xì)胞的直徑7 μm～

26、18 μm，豬、牛、羊ES細(xì)胞的顏色較深，直徑12 μm～18 μm。,,,采用這一方法的優(yōu)點(diǎn)是，外源DNA的整合率高； 整合在生殖細(xì)胞中的比例也很高。缺點(diǎn)是，ES細(xì)胞株不易建立，長(zhǎng)期培養(yǎng)后出現(xiàn)細(xì)胞分化現(xiàn)象；生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物都是嵌合體。,(四)精子載體法 將外源DNA與精子一起孵育，精子可捕獲外源DNA，并通過(guò)受精過(guò)程將外源DNA導(dǎo)入受精卵。此法不僅可免去復(fù)雜而昂貴的設(shè)備， 且可省去不少繁雜的操作和條件準(zhǔn)備。但該法有些結(jié)果不能重復(fù)。此

27、外，還有一些其它的方法，都有不同的優(yōu)缺點(diǎn)。,(五)基因敲除的小鼠模型的建立方法,基因敲除是向正常生物個(gè)體內(nèi)引入某個(gè)突變基因位點(diǎn)而選擇性地使某特定基因功能失活的技術(shù).可培養(yǎng)出靶向性剔除某基因的小鼠，而導(dǎo)致行為特性改變。,培育基因靶向性敲除小鼠的實(shí)施步驟為：1.首先將某基因突變位點(diǎn)經(jīng)同源重組引入小鼠ES細(xì)胞。2.將含有靶向敲除的突變基因位點(diǎn)的ES細(xì)胞注入小鼠早期胚胎中, 孕育出嵌合小鼠, 此嵌合小鼠體內(nèi)胚系細(xì)胞群和體細(xì)胞群都會(huì)有來(lái)自E

28、S細(xì)胞和受者胚胎鼠細(xì)胞的DNA。,3.檢測(cè)嵌合小鼠交配后的生殖細(xì)胞內(nèi)是否整合有突變的基因位點(diǎn)。4.在各只敲除的突變基因位點(diǎn)雜合性小鼠之間交配, 以產(chǎn)生純合性基因敲除小鼠。,特點(diǎn),培養(yǎng)成功率低，技術(shù)難度大，盡管對(duì)研究遺傳與疾病的相關(guān)性十分有用，但若敲除致命的功能基因，可使胚胎早期發(fā)生死亡。若所敲除基因可被其他功能基因代償，則使表型改變模糊不明，有局限性。,（六）細(xì)胞核移植法,,核移植也稱克隆或無(wú)性繁殖，是將分離的胚胎卵裂球(核供體)或體

29、細(xì)胞核與成熟并去核的卵母細(xì)胞或去核的原核期受精卵的去核胚胎(核受體)融合，不經(jīng)過(guò)有性繁殖過(guò)程，連續(xù)不斷地復(fù)制遺傳上相同的胚胎，并通過(guò)克隆胚胎的移植生產(chǎn)大量同基因型的克隆動(dòng)物系或動(dòng)物群的一項(xiàng)動(dòng)物繁殖新技術(shù)。,小結(jié),五、轉(zhuǎn)基因鼠的檢測(cè)待假孕母鼠產(chǎn)出幼仔后,可用幼鼠尾巴提取DNA;對(duì)于一些基因調(diào)控研究,需要盡快獲得信息而暫不需保留轉(zhuǎn)基因鼠，從胎鼠組織或幼鼠尾巴提取的DNA,可用PCR、Dot blot(斑點(diǎn)雜交)、Southern blo

30、t(Southern轉(zhuǎn)移)等多種方法分析以確定是否轉(zhuǎn)基因鼠。,六、基因轉(zhuǎn)移后的存在方式及表達(dá)(一)外源基因?qū)牒蟮拇嬖诜绞剑和庠椿虮粚?dǎo)入受體細(xì)胞后，在受體細(xì)胞內(nèi)的存在方式有三種：1. 非同源重組。大多數(shù)外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后,與受體細(xì)胞染色體的某一位點(diǎn)隨機(jī)整合，這樣可帶來(lái)正?；虻牟迦搿⑷笔?、易位等突變。2. 同源重組。導(dǎo)入的外源DNA與受體細(xì)胞染色體的DNA 通過(guò)順序取代或順序插入實(shí)現(xiàn)同源重組。通過(guò)同源重組有可能導(dǎo)致受體細(xì)胞正

31、常的基因發(fā)生突變，當(dāng)然，也有可能代替原來(lái)的有遺傳缺陷的遺傳基因，從而糾正遺傳缺陷。,3. 游離存在。外源基因沒(méi)有整合到受體細(xì)胞中,而是以附加體的形式游離在受體細(xì)胞內(nèi)，能自我復(fù)制，并能100％的傳給下一代。,(二)外源基因?qū)牒蟮谋磉_(dá)：外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后能否表達(dá)，是受許多因素影響的。1. 外源基因本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。2. 附帶的原核載體順序。研究發(fā)現(xiàn)，原核載體的存在對(duì)α-甲胎蛋白、β- 珠蛋白等基因的表達(dá)具有明顯的抑制作用，而對(duì)免疫

32、球蛋白和膠原蛋白基因的抑制不明顯。,3. 染色體位置。 外源基因在受體動(dòng)物細(xì)胞染色體上整合部位的基因環(huán)境對(duì)外源基因表達(dá)的影響很大。4. 甲基化。被轉(zhuǎn)移的基因容易甲基化而失活。外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)方式表現(xiàn)為組織特異性和發(fā)育階段特異性。組織特異性表達(dá)是由于某些調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的作用造成的。,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用研究,改良動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀的嘗試試圖通過(guò)轉(zhuǎn)移單個(gè)基因改良動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀的研究，至今仍未見(jiàn)成功的報(bào)道，尚需對(duì)性狀表現(xiàn)的生化代

33、謝途徑，有關(guān)基因的相互作用以及基因定位整合，基因定量表達(dá)、組織特異性表達(dá)等進(jìn)行深入的研究。,乳腺生物反應(yīng)器的研究1987年，Gordon首次報(bào)道小鼠乳腺中表達(dá)tPA蛋白。至今國(guó)際上轉(zhuǎn)基因羊、轉(zhuǎn)基因牛等的成功報(bào)道實(shí)例已有10多種，生產(chǎn)出抗胰蛋白酶、乳鐵蛋白、人凝血蛋白因子Ⅷ、蛋白質(zhì)C等藥用蛋白。國(guó)外經(jīng)濟(jì)學(xué)家預(yù)期，10年后，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的藥物銷售額超過(guò)250億美元。,基因藥物生產(chǎn),基因藥物生產(chǎn)第一階段是細(xì)菌基因工程，第二階段是動(dòng)物細(xì)胞基

34、因工程，第三階段是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物—乳腺生物反應(yīng)器。具有以下特點(diǎn)：⑴乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達(dá)的蛋白質(zhì)不回流到血液循環(huán)系統(tǒng)，避免外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物本身的影響；,⑵乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器。一頭奶牛一年可生產(chǎn)乳蛋白250—300Kg，一只綿羊或山羊一年可生產(chǎn)乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代換成醫(yī)用蛋白，產(chǎn)量十分可觀。,⑶乳腺分泌的基因產(chǎn)物不但產(chǎn)量高，而且易提純。表達(dá)的蛋白經(jīng)過(guò)充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。

35、生物活性接近天然產(chǎn)品。⑷在動(dòng)物乳腺表達(dá)的外源基因可以遺傳，可用常規(guī)技術(shù)繁殖生產(chǎn)群體。,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究存在的問(wèn)題,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的低效性 轉(zhuǎn)入基因引起完整基因突變 轉(zhuǎn)入基因表達(dá)混亂 病毒轉(zhuǎn)基因?qū)λ拗鞯挠绊?轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型與預(yù)期不符 乳腺反應(yīng)器的完善 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及產(chǎn)品的認(rèn)可,動(dòng)物克隆的重大意義,動(dòng)物克隆技術(shù)不僅理論上有重大突破，無(wú)需有性繁殖即可生產(chǎn)動(dòng)物，而且可利用克隆羊技術(shù)來(lái)克隆人體器官，有醫(yī)學(xué)價(jià)值，還可使難以生殖或即將滅種的動(dòng)物