人MAN2C1轉基因動物模型的建立及相關研究.pdf

1、MAN2C1是本實驗室克隆的cDNA編碼的1個人α-甘露糖苷酶。我們原先稱它為6A8α-甘露糖苷酶。國際已命名此酶為mannosidase，alpha，class2C，member1[Homosapiens]，簡稱MAN2C1。其相應的基因位于染色體15q11-q13。HUGO基因命名委員會命名此基因為MAN2C1。MAN2C1的分子量在非糖基化情況下為～116kDa。 為研究MAN2C1的生物學意義，本實驗室用反義技術抑制MA

2、N2C1基因在細胞中的表達，觀察到：人B淋巴細胞瘤細胞株BJAB發(fā)生腫脹樣死亡；人T淋巴瘤細胞株Jurkat細胞間黏附增強，包括CD54和LFA-1等不少黏附分子及與黏附相關的分子的表達增強，細胞的骨架蛋白發(fā)生重排；EB病毒轉化的人B細胞SKW6對抗-Fas抗體誘導的凋亡發(fā)生抵抗；人鼻咽癌細胞株CNE-2L2的惡性生物學行為(腫瘤的生長和轉移)減弱，細胞間的黏附增強，細胞的E-鈣黏蛋白表達增高，細胞的端粒變短。但是，要深入了解MAN2C

3、1的生物學意義，除了進一步研究MAN2C1基因表達對多種細胞生物學行為的影響外，還必須在整體水平作研究。這包括制備轉基因動物和基因敲除動物。本碩士論文工作的目的是制備轉人MAN2C1基因小鼠。我構建了表達載體pIRES2-EGFP-MAN2C1，熒光檢測表明它轉入細胞后能表達插入的基因。為使基因整合入基因組的效率增高，把pIRES2-EGFP-MAN2C1切成線狀。轉染細胞的實驗表明，線性化對基因的表達沒有影響。轉基因小鼠在北京實驗動物

4、中心制備。得到小鼠后，用基因組PCR檢測MAN2C1基因整合入小鼠基因組的情況。在北京實驗動物中心提供的116只小鼠中，共檢測到8只陽性小鼠。經配對繁殖得到F1代小鼠?；蚪MPCR檢測見～1/2小鼠為陽性。陽性F1代小鼠合籠在F2代有～3/4小鼠陽性。用RT-PCR檢測了MAN2C1基因在轉基因鼠尾部組織中的轉錄，在7個系的小鼠中有4個為MAN2C1mRNA陽性。為作Western印跡檢測，我在原核細胞表達了MAN2C1分子的中的gly

5、co_hydro_38結構域蛋白，用它免疫小鼠，制備了抗MAN2C1的單克隆抗體3B10。用單克隆抗體3B10作探針，取小鼠尾部組織，提取蛋白質，Western印跡檢測見這4個系的小鼠為陽性。這表明，我已成功地制備了轉MAN2C1基因小鼠。我對轉MAN2C1基因小鼠與對照小鼠的胸腺、脾臟、骨髓及小腸作了組織學比較，未發(fā)現(xiàn)明顯差異。我還比較了轉MAN2C1基因小鼠與對照小鼠小腸上皮細胞的增殖情況，也未發(fā)現(xiàn)明顯差異。 本論文工作還構