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1、藥物制劑的微生物學(xué)檢查,第一節(jié) 中藥制劑的無菌檢查,滅菌制劑與無菌制劑的概念 滅菌制劑:系指采用某一物理、化學(xué)方法殺滅或除去所有活的微生物繁殖體和芽胞的一類藥物制劑。 無菌制劑:系指采用某一無菌操作方法或技術(shù)制備的不含任何活的微生物繁殖體和芽胞的一類藥物制劑。 無菌制劑包括:注射用制劑,眼用制劑;植入型制劑;創(chuàng)面用制劑;手術(shù)用制劑等直接注射于體內(nèi)或直接用于創(chuàng)面、黏膜等的一類制劑。
2、 這些制劑必須保證不含活的微生物,否則注入人體將會(huì)引起嚴(yán)重的事故。因此,在出廠、上市前都必須按藥典規(guī)定的方法進(jìn)無菌檢查。,一、無菌檢驗(yàn)的基本原則,1.嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作 無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10 000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行,其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,防止徽生物污染。2.建立方法的驗(yàn)證 進(jìn)行藥品的無菌檢查法時(shí),應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證,以證明所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查。若藥品
3、的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí),檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。3.相關(guān)試劑及培養(yǎng)條件 供試品檢查時(shí),使用的表面活性劑、中和劑或滅活劑,應(yīng)證明其有效性及對(duì)微生物的生長和存活無影響。將供試品分別接種于適合需氧菌、厭氧菌、霉菌生長的培養(yǎng)基中,在適宜條件下培養(yǎng),細(xì)菌培養(yǎng)溫度為30~37℃;霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23~28℃。,4.正確采集樣品 無菌檢驗(yàn)是對(duì)整體中部分樣品進(jìn)行隨機(jī)抽檢,來推斷整體是否有菌的情況(無菌或染菌
4、)。因此,在一批藥品的無菌檢驗(yàn)中,取樣數(shù)量愈少,染菌的檢出率愈?。蝗佑?,染菌的檢出率愈大,該批藥品通過無菌檢驗(yàn)的幾率愈小。無菌檢驗(yàn)時(shí)取樣量和比例必須嚴(yán)格按規(guī)定執(zhí)行。5.檢查結(jié)果判斷 需氧菌、厭氧菌及霉菌檢查中任何一不符合者,則判供試品不合格。,二、無菌檢查的基本方法,(一)一般注射劑的無菌檢查 1.一般注射劑指本身不含有任何抗菌或抑菌成分,劑型為 水溶性藥品的無菌檢查。
5、 2.包含需氧菌、厭氧菌和真菌三類微生物的檢查。 3.方法:直接接種法 4.將供試品按量分別直接接種于適宜需氧菌、厭氧菌和真 菌生長繁殖的一定量培養(yǎng)基中。,直接接種法圖示,無抗菌作用的供試品,抽樣,,接種于培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基管,培養(yǎng),,,細(xì)菌 37℃ 霉菌、酵母菌 25℃,接種,第二節(jié) 藥物的微生物限度檢查,藥物的微生物限度檢查,是指非規(guī)定滅菌制劑(
6、如口服藥及外用藥物)及其原、輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法。 檢驗(yàn)項(xiàng)目主要有:細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)和控制菌檢測(cè)。,藥典化學(xué)藥制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求,無菌檢查:注射劑、植入劑、沖洗劑。無菌檢查及微生物限度檢查:軟膏劑、眼用制劑、氣霧劑、噴霧劑、散劑、耳用制劑、鼻用制劑、凝膠劑、 乳膏劑。 微生物限度檢查:粉霧劑、口服溶液劑、口服混懸劑 、口服乳劑、搽劑、洗劑、局部用片劑、酊劑、栓劑、糖漿劑、膜劑、貼劑、灌腸劑
7、、糊劑、涂劑、涂膜劑 。原則性要求:丸劑、口服片劑、膠囊劑、顆粒劑。,藥典中藥制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求,無菌檢查:注射劑。無菌檢查及微生物限度檢查:散劑、軟膏劑、眼用制劑、 鼻用制劑、氣霧劑*、噴霧劑。 微生物限度檢查:丸劑、顆粒劑、片劑、錠劑、煎膏 劑、膠劑、糖漿劑、合劑、滴丸劑、膠囊劑、酒劑、 酊劑、流浸膏劑、浸膏劑、露劑、茶劑、栓劑、貼膏 劑(貼劑)、凝膠劑、搽劑、洗劑、涂膜
8、劑.不要求:膏藥。,二、口服及外用中藥的微生物學(xué)檢查,口服制劑:細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)、大腸桿菌和活螨的檢測(cè)外用藥物:綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、破傷風(fēng)梭菌一般眼科制劑:細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌 以上藥物均不能檢出致病菌!,實(shí)驗(yàn)方法,(一)、蜜丸細(xì)菌總數(shù)測(cè)定(二)、蜜丸霉菌總數(shù)測(cè)定1、無菌條件下隨機(jī)稱取10g蜜丸置研缽中逐漸加入100ml生理鹽水研磨為1:10藥液,分別量取9ml生理鹽水置10ml 具塞刻度
9、試管中,其中一支加入1:10藥液1ml后稀釋為1:100后再取1ml加入9ml生理鹽水具塞刻度試管中藥物稀釋為1:1000。,2、取10個(gè)干烤后玻璃平皿,其中6個(gè)平皿,每2個(gè)分別加入1:10,1:100,1:1000藥液各1ml,然后加入50℃普通瓊脂培養(yǎng)基、(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)15ml做細(xì)菌培養(yǎng);剩余的4個(gè)平皿,每2個(gè)分別加入1:10,1:100,藥液各1ml共4個(gè),然后加入50℃虎紅馬丁培養(yǎng)基15ml做霉菌培養(yǎng),并立刻轉(zhuǎn)
10、動(dòng)平板使藥液與培養(yǎng)基充分混勻。10個(gè)平板置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后并計(jì)數(shù)每個(gè)稀釋度的3個(gè)平板的菌落均數(shù)。,3、選取菌落平均值在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)的測(cè)定范圍,將數(shù)得的菌落數(shù)乘以相應(yīng)的稀釋度得到每克檢測(cè)蜜丸中細(xì)菌總數(shù)。選取霉菌菌落平均值在5-50之間的平板作為霉菌總數(shù)的測(cè)定范圍,將數(shù)得的菌落數(shù)乘以相應(yīng)的稀釋度得到每克檢測(cè)蜜丸中霉菌總數(shù)。,①當(dāng)僅有1個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定,以該級(jí)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)。
11、②當(dāng)同時(shí)有2個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時(shí),視兩者比值而定。 若比值<2, 以兩稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的均值報(bào)告菌落數(shù); 若比值>2但<5時(shí),以低稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌落數(shù); 當(dāng)出現(xiàn)比值>5,或高稀釋級(jí)的菌落數(shù)≥低稀釋級(jí)的菌落數(shù)等異常情況時(shí),應(yīng)查明原因再行檢查,必要時(shí),應(yīng)進(jìn)行方法的重新驗(yàn)證。,高稀釋級(jí)的菌落數(shù)×稀釋倍數(shù),,低稀釋級(jí)的菌落數(shù)×稀釋倍數(shù),=,比值,菌落數(shù)報(bào)
12、告規(guī)則,③當(dāng)各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均<30個(gè),以最低稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。④若各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均>300個(gè),以最高稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。⑤若各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均不在30~300個(gè)之間,一個(gè)稀釋度大于300個(gè),相鄰另一個(gè)稀釋度小于30個(gè),則以接近30~300個(gè)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。如各稀釋級(jí)的平板均無菌落生長,或測(cè)定數(shù)在10個(gè)以下時(shí),報(bào)告菌數(shù)為<10個(gè)。,,,被檢藥物細(xì)
13、菌、霉菌總數(shù)應(yīng)在藥典規(guī)定的限量以內(nèi),否則為不合格。如中藥濃縮丸、中成藥片劑及西藥片劑細(xì)菌數(shù)每克不得超過1000個(gè);中藥蜜丸、小丸每克不得超過10000個(gè)。中藥蜜丸、水丸霉菌數(shù)每克不得超過500個(gè);中藥濃縮丸霉菌數(shù)每克不得超過100個(gè)。,(二)致病菌檢測(cè),陽性對(duì)照試驗(yàn): 供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí),應(yīng)做陽性對(duì)照試驗(yàn)。陽性對(duì)照試驗(yàn)的加菌量為10~100 CFU,方法同供試品的控制菌檢查。陽性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 陰性對(duì)照
14、試驗(yàn): 取稀釋液10ml照相應(yīng)控制菌檢查法檢查,作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長。,1.大腸埃希菌的檢查 大腸埃希菌是人和動(dòng)物腸道中寄生的正常菌群,隨糞便排出體外,可直接或間接污染藥物及藥品生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)。服用后有可能被糞便中存在的腸道致病菌或寄生蟲卵等病原體感染。因此,大腸埃希菌被列為糞便污染指示菌,是口服藥品常規(guī)必檢項(xiàng)目。,(二)致病菌檢測(cè),大腸埃希菌檢查程序
15、 供試品(1:10稀釋)→ 供試液10ml ↓ 不少于100ml的乳糖膽鹽增菌液
16、 ↓37℃ 18~24h 取增菌液劃線轉(zhuǎn)種 ↓ 伊紅美蘭瓊脂平板(或麥康凱瓊脂平板) ↓ ┌────────────┐,陰性 菌落紫黑色、有金屬光澤,乳糖發(fā)酵、IMViC試驗(yàn),,發(fā)酵
17、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、MViC:+ + - -,,(1)增菌 目的:抑制不需要的細(xì)菌生長,而有利于需檢菌的生長。培養(yǎng)基:乳糖膽鹽 (BL)培養(yǎng)基,作用:膽鹽(或去氧膽酸鈉)具有抑制革蘭陽性細(xì)菌生長的作用。 方法:按該品種驗(yàn)證的方法將供試液10ml接種至100ml的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中, 37℃培養(yǎng)18~24h,必要時(shí)可延至48h。,(2)分離培養(yǎng): 伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)或麥康凱瓊脂(MacC)平板 將
18、上述培養(yǎng)液劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板,37℃培養(yǎng)18~24h。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符,判供試品未檢出大腸埃希菌。,大腸埃希菌菌落形態(tài)特征,劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板,大腸埃希菌在麥康凱瓊脂平板上 發(fā)酵乳糖菌落,大腸埃希菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的菌落特征,(3)純培養(yǎng)、染色、鏡檢,觀察染色性及形態(tài)(4)生化反應(yīng) 主要是與產(chǎn)氣桿菌進(jìn)行鑒別,大腸埃希菌與產(chǎn)氣桿菌兩者在形態(tài)、染
19、色性、菌落等方面十分相似。因此,須通過生化反應(yīng)來鑒別。挑取可疑菌落做乳糖發(fā)酵試驗(yàn)和IMViC試驗(yàn)——吲哚試驗(yàn)(I)、甲基紅試驗(yàn)(M)、V-P試驗(yàn)(Vi)和枸椽酸鹽利用試驗(yàn)(C)試驗(yàn)。 結(jié)果:大腸埃希菌為+ + - - 產(chǎn)氣桿菌則為- - + + (5)結(jié)果報(bào)告 完全符合以下結(jié)果:①革蘭氏陰性無芽孢桿菌;②乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣;③IMViC試驗(yàn)反應(yīng)為++--。應(yīng)判定為檢出大腸埃希菌。,吲哚試驗(yàn)(I)+
20、 -,甲基紅試驗(yàn)(M) + -,VP試驗(yàn)(Vi)+ -,枸椽酸鹽利用試驗(yàn)(C) + -,I-吲哚(indol)試驗(yàn)色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚 ↑ 吲哚試劑,,- +,M - 甲基紅(methyl red)實(shí)驗(yàn)葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇 甲基紅 -葡萄糖→丙酮酸
21、 甲基紅 +,- +,V - VP(Voges-Proskauer)試驗(yàn),葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇 →二乙酰→紅色化合物 + 胍基化合物葡萄糖→丙酮酸 × × 乙酰甲基甲醇
22、 -,- +,,C -枸櫞酸鹽利用(citrate utilization)試驗(yàn),,利用枸櫞酸鹽生長 +不能利用 -,- +,第三節(jié) 藥物的抗菌試驗(yàn),藥物的抗菌試驗(yàn)?zāi)康氖菫榱藱z查藥物的抗菌能力,包括藥物的抑菌試驗(yàn)和殺菌試驗(yàn)。 一般先進(jìn)行體外抗菌試驗(yàn),再進(jìn)行體內(nèi)抗菌試驗(yàn)。該項(xiàng)試驗(yàn)方法 已廣泛應(yīng)用于新
23、藥研究和指導(dǎo)臨床用藥。,(一)體外抑菌試驗(yàn),1.連續(xù)稀釋法 用于測(cè)定藥物的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC), MIC是指藥物能抑制細(xì)菌生長的最高稀釋度,以μg/ml或U/ml表示,數(shù)值愈小,藥物的抑菌作用愈強(qiáng)。(1)液體培養(yǎng)基稀釋法: 在試管中用液體培養(yǎng)基進(jìn)行2倍系列稀釋藥物→ 在每管中加等量的試驗(yàn)菌液→ 16~24h培養(yǎng)→觀察結(jié)果,以能抑制試驗(yàn)菌生長的最低濃度
24、(最高藥物稀釋度)為該藥的MIC。,液體培養(yǎng)基稀釋法藥敏試驗(yàn)的抗生素溶液稀釋方案,判斷抑菌還是殺菌,應(yīng)將未長菌的試管內(nèi)培養(yǎng)液再移種于瓊脂平板上,如重新長出試驗(yàn)菌,表明該濃度只是抑菌濃度。藥物的抑菌或殺菌作用是在一定條件下相對(duì)而言的,這與用藥時(shí)培養(yǎng)基的組成、pH及所用的菌種、菌量等因素有關(guān),所以必須嚴(yán)格控制試驗(yàn)菌、培養(yǎng)基等試驗(yàn)條件。,液體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定藥物的最小抑菌濃度(MIC),液體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)通過平板培養(yǎng)證
25、實(shí),最小殺菌濃度(minimal bactericidal concentration,MBC),按液體培養(yǎng)基稀釋法操作測(cè)出藥物的MIC,將未長菌的各管培養(yǎng)液分別移種到無菌平板上,培養(yǎng)后以無細(xì)菌生長的最低藥物濃度(最高藥物稀釋度)作為該藥物的MBC。,(2)固體培養(yǎng)基稀釋法:1)平板法: 方法:將不同濃度的藥液按1︰9混入尚未凝固的瓊脂培養(yǎng)基中→ 制作成含有遞減濃度藥物的瓊脂平板→將定量的菌液點(diǎn)種法逐個(gè)點(diǎn)種于平板→ 37℃培養(yǎng)
26、24h → 測(cè)得各種細(xì)菌對(duì)藥物的MIC。 應(yīng)用:測(cè)定多種細(xì)菌對(duì)同一藥物的MIC; 各種藥物的抗菌活性測(cè)定; 新抗菌藥物的篩選。 優(yōu)點(diǎn):不受藥物顏色及渾濁度的影響,且手續(xù)簡(jiǎn)便。2)斜面法: 方法:將不同遞減濃度的藥液→混入未凝固的裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管中→制成斜面→接種定量的試驗(yàn)菌液→培養(yǎng)→測(cè)知MIC (μg/ml)。 應(yīng)用:適用于必須較長時(shí)間培養(yǎng)的試驗(yàn)菌(如結(jié)核桿菌
27、)或避免孢子飛揚(yáng)污染環(huán)境的霉菌。,,2.瓊脂擴(kuò)散法 原理:是利用藥物在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散,并在一定濃度范圍內(nèi)抑制細(xì)菌生長,形成無菌生長的透明圈即為抑菌環(huán)。抑菌環(huán)的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度,并與該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(抑菌環(huán)越大, MIC 越?。?。 方法:在瓊脂平板上→接種(涂布法或傾注法)試驗(yàn)菌→加藥于平板上→培養(yǎng)18~24h→觀察測(cè)量抑菌環(huán)直徑,或抑菌范圍的大小→評(píng)價(jià)藥物抗菌作用的強(qiáng)弱。
28、 應(yīng)用: 用于定性試驗(yàn); 初步判斷藥物的抗菌作用的大小。,,(1)濾紙片法: 方法:①無菌濾紙片→蘸取一定濃度的抗菌藥物→放置 于含菌平板表面。 ②將預(yù)先配制含藥的干紙片→貼在接種細(xì)菌的 平板表面。 以游標(biāo)卡尺精確量取抑菌環(huán)的直徑大小, 判斷該菌對(duì)該藥物
29、的 耐藥 (resistant,R)、 中介(intermediate,I) 敏感(susceptible,S),,結(jié)果判斷:,,,,,,抑菌試驗(yàn),顯 示 抑 菌 環(huán),優(yōu)點(diǎn):在1個(gè)平板上測(cè)定多種藥物對(duì)同一試驗(yàn)菌的抗菌作用 應(yīng)用:新藥的初篩試驗(yàn),以初步判斷新藥是否具有抗菌作用 病原菌的藥物敏感試驗(yàn),供醫(yī)生選用藥物時(shí)參
30、考 藥敏試驗(yàn)結(jié)果解釋: “耐藥”(R):即表示測(cè)試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制,臨床治療無效; “中介”(I):提示該細(xì)菌對(duì)常規(guī)用藥體液或組織中的藥物濃度的反應(yīng)率低于敏感株,使用高于正常給藥量有療效; “敏感”(S):即表示測(cè)試菌可被測(cè)定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達(dá)到的血藥濃度所抑制。,,(2)打孔法和管碟法: 在含有試驗(yàn)菌的平板上打孔或放置管碟,然后向孔內(nèi)加入不同濃度的待測(cè)藥物
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