藥物制劑的微生物學(xué)檢測(cè)

1、藥物制劑的微生物學(xué)檢查,第一節(jié) 中藥制劑的無菌檢查,滅菌制劑與無菌制劑的概念 滅菌制劑：系指采用某一物理、化學(xué)方法殺滅或除去所有活的微生物繁殖體和芽胞的一類藥物制劑。 無菌制劑：系指采用某一無菌操作方法或技術(shù)制備的不含任何活的微生物繁殖體和芽胞的一類藥物制劑。 無菌制劑包括：注射用制劑，眼用制劑；植入型制劑；創(chuàng)面用制劑；手術(shù)用制劑等直接注射于體內(nèi)或直接用于創(chuàng)面、黏膜等的一類制劑。

2、 這些制劑必須保證不含活的微生物，否則注入人體將會(huì)引起嚴(yán)重的事故。因此，在出廠、上市前都必須按藥典規(guī)定的方法進(jìn)無菌檢查。,一、無菌檢驗(yàn)的基本原則,1.嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作 無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10 000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止徽生物污染。2.建立方法的驗(yàn)證 進(jìn)行藥品的無菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以證明所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查。若藥品

3、的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)重新驗(yàn)證。3.相關(guān)試劑及培養(yǎng)條件 供試品檢查時(shí)，使用的表面活性劑、中和劑或滅活劑，應(yīng)證明其有效性及對(duì)微生物的生長和存活無影響。將供試品分別接種于適合需氧菌、厭氧菌、霉菌生長的培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)溫度為30～37℃；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為23～28℃。,4.正確采集樣品 無菌檢驗(yàn)是對(duì)整體中部分樣品進(jìn)行隨機(jī)抽檢，來推斷整體是否有菌的情況(無菌或染菌

4、)。因此，在一批藥品的無菌檢驗(yàn)中，取樣數(shù)量愈少，染菌的檢出率愈?。蝗佑?，染菌的檢出率愈大，該批藥品通過無菌檢驗(yàn)的幾率愈小。無菌檢驗(yàn)時(shí)取樣量和比例必須嚴(yán)格按規(guī)定執(zhí)行。5.檢查結(jié)果判斷 需氧菌、厭氧菌及霉菌檢查中任何一不符合者，則判供試品不合格。,二、無菌檢查的基本方法,（一）一般注射劑的無菌檢查 1.一般注射劑指本身不含有任何抗菌或抑菌成分，劑型為 水溶性藥品的無菌檢查。

5、 2.包含需氧菌、厭氧菌和真菌三類微生物的檢查。 3.方法：直接接種法 4.將供試品按量分別直接接種于適宜需氧菌、厭氧菌和真 菌生長繁殖的一定量培養(yǎng)基中。,直接接種法圖示,無抗菌作用的供試品,抽樣,,接種于培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基管,培養(yǎng),,,細(xì)菌 37℃ 霉菌、酵母菌 25℃,接種,第二節(jié) 藥物的微生物限度檢查,藥物的微生物限度檢查，是指非規(guī)定滅菌制劑（

6、如口服藥及外用藥物）及其原、輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法。 檢驗(yàn)項(xiàng)目主要有：細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)和控制菌檢測(cè)。,藥典化學(xué)藥制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求,無菌檢查：注射劑、植入劑、沖洗劑。無菌檢查及微生物限度檢查：軟膏劑、眼用制劑、氣霧劑、噴霧劑、散劑、耳用制劑、鼻用制劑、凝膠劑、 乳膏劑。 微生物限度檢查：粉霧劑、口服溶液劑、口服混懸劑 、口服乳劑、搽劑、洗劑、局部用片劑、酊劑、栓劑、糖漿劑、膜劑、貼劑、灌腸劑

7、、糊劑、涂劑、涂膜劑 。原則性要求：丸劑、口服片劑、膠囊劑、顆粒劑。,藥典中藥制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求,無菌檢查：注射劑。無菌檢查及微生物限度檢查：散劑、軟膏劑、眼用制劑、 鼻用制劑、氣霧劑*、噴霧劑。 微生物限度檢查：丸劑、顆粒劑、片劑、錠劑、煎膏 劑、膠劑、糖漿劑、合劑、滴丸劑、膠囊劑、酒劑、 酊劑、流浸膏劑、浸膏劑、露劑、茶劑、栓劑、貼膏 劑(貼劑)、凝膠劑、搽劑、洗劑、涂膜

8、劑.不要求：膏藥。,二、口服及外用中藥的微生物學(xué)檢查,口服制劑：細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)、大腸桿菌和活螨的檢測(cè)外用藥物：綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、破傷風(fēng)梭菌一般眼科制劑：細(xì)菌總數(shù)、霉菌總數(shù)、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌 以上藥物均不能檢出致病菌！,實(shí)驗(yàn)方法,（一）、蜜丸細(xì)菌總數(shù)測(cè)定（二）、蜜丸霉菌總數(shù)測(cè)定1、無菌條件下隨機(jī)稱取10g蜜丸置研缽中逐漸加入100ml生理鹽水研磨為1：10藥液，分別量取9ml生理鹽水置10ml 具塞刻度

9、試管中，其中一支加入1：10藥液1ml后稀釋為1：100后再取1ml加入9ml生理鹽水具塞刻度試管中藥物稀釋為1：1000。,2、取10個(gè)干烤后玻璃平皿，其中6個(gè)平皿，每2個(gè)分別加入1：10，1：100，1：1000藥液各1ml，然后加入50℃普通瓊脂培養(yǎng)基、（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）15ml做細(xì)菌培養(yǎng)；剩余的4個(gè)平皿，每2個(gè)分別加入1：10，1：100，藥液各1ml共4個(gè)，然后加入50℃虎紅馬丁培養(yǎng)基15ml做霉菌培養(yǎng)，并立刻轉(zhuǎn)

10、動(dòng)平板使藥液與培養(yǎng)基充分混勻。10個(gè)平板置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后并計(jì)數(shù)每個(gè)稀釋度的3個(gè)平板的菌落均數(shù)。,3、選取菌落平均值在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)的測(cè)定范圍，將數(shù)得的菌落數(shù)乘以相應(yīng)的稀釋度得到每克檢測(cè)蜜丸中細(xì)菌總數(shù)。選取霉菌菌落平均值在5-50之間的平板作為霉菌總數(shù)的測(cè)定范圍，將數(shù)得的菌落數(shù)乘以相應(yīng)的稀釋度得到每克檢測(cè)蜜丸中霉菌總數(shù)。,①當(dāng)僅有1個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級(jí)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)。

11、②當(dāng)同時(shí)有2個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時(shí)，視兩者比值而定。 若比值＜2, 以兩稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的均值報(bào)告菌落數(shù)； 若比值＞2但＜5時(shí)，以低稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌落數(shù)； 當(dāng)出現(xiàn)比值＞5，或高稀釋級(jí)的菌落數(shù)≥低稀釋級(jí)的菌落數(shù)等異常情況時(shí)，應(yīng)查明原因再行檢查，必要時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的重新驗(yàn)證。,高稀釋級(jí)的菌落數(shù)×稀釋倍數(shù),,低稀釋級(jí)的菌落數(shù)×稀釋倍數(shù),＝,比值,菌落數(shù)報(bào)

12、告規(guī)則,③當(dāng)各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均＜30個(gè)，以最低稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。④若各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均＞300個(gè)，以最高稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。⑤若各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均不在30～300個(gè)之間，一個(gè)稀釋度大于300個(gè)，相鄰另一個(gè)稀釋度小于30個(gè)，則以接近30～300個(gè)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。如各稀釋級(jí)的平板均無菌落生長，或測(cè)定數(shù)在10個(gè)以下時(shí)，報(bào)告菌數(shù)為＜10個(gè)。,,,被檢藥物細(xì)

13、菌、霉菌總數(shù)應(yīng)在藥典規(guī)定的限量以內(nèi)，否則為不合格。如中藥濃縮丸、中成藥片劑及西藥片劑細(xì)菌數(shù)每克不得超過1000個(gè)；中藥蜜丸、小丸每克不得超過10000個(gè)。中藥蜜丸、水丸霉菌數(shù)每克不得超過500個(gè)；中藥濃縮丸霉菌數(shù)每克不得超過100個(gè)。,（二）致病菌檢測(cè),陽性對(duì)照試驗(yàn)： 供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽性對(duì)照試驗(yàn)。陽性對(duì)照試驗(yàn)的加菌量為10～100 CFU，方法同供試品的控制菌檢查。陽性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 陰性對(duì)照

14、試驗(yàn)： 取稀釋液10ml照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長。,1．大腸埃希菌的檢查 大腸埃希菌是人和動(dòng)物腸道中寄生的正常菌群，隨糞便排出體外，可直接或間接污染藥物及藥品生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)。服用后有可能被糞便中存在的腸道致病菌或寄生蟲卵等病原體感染。因此，大腸埃希菌被列為糞便污染指示菌，是口服藥品常規(guī)必檢項(xiàng)目。,（二）致病菌檢測(cè),大腸埃希菌檢查程序

15、 供試品（1:10稀釋）→ 供試液10ml 　　 ↓　 不少于100ml的乳糖膽鹽增菌液 　

16、 ↓37℃　18~24h 取增菌液劃線轉(zhuǎn)種 ↓ 伊紅美蘭瓊脂平板（或麥康凱瓊脂平板） ↓　　　　　　　 ┌────────────┐,陰性 菌落紫黑色、有金屬光澤,乳糖發(fā)酵、IMViC試驗(yàn),,發(fā)酵

17、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、MViC：+ + - -,,（1）增菌 目的:抑制不需要的細(xì)菌生長，而有利于需檢菌的生長。培養(yǎng)基:乳糖膽鹽 (BL)培養(yǎng)基，作用:膽鹽(或去氧膽酸鈉)具有抑制革蘭陽性細(xì)菌生長的作用。 方法：按該品種驗(yàn)證的方法將供試液10ml接種至100ml的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中， 37℃培養(yǎng)18～24h，必要時(shí)可延至48h。,（2）分離培養(yǎng)： 伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)或麥康凱瓊脂（MacC）平板 將

18、上述培養(yǎng)液劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24h。若平板上無菌落生長、或生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。,大腸埃希菌菌落形態(tài)特征,劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板,大腸埃希菌在麥康凱瓊脂平板上 發(fā)酵乳糖菌落,大腸埃希菌在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上的菌落特征,（3）純培養(yǎng)、染色、鏡檢，觀察染色性及形態(tài)（4）生化反應(yīng) 主要是與產(chǎn)氣桿菌進(jìn)行鑒別，大腸埃希菌與產(chǎn)氣桿菌兩者在形態(tài)、染

19、色性、菌落等方面十分相似。因此，須通過生化反應(yīng)來鑒別。挑取可疑菌落做乳糖發(fā)酵試驗(yàn)和IMViC試驗(yàn)——吲哚試驗(yàn)（I）、甲基紅試驗(yàn)(M)、V-P試驗(yàn)(Vi)和枸椽酸鹽利用試驗(yàn)(C)試驗(yàn)。 結(jié)果：大腸埃希菌為+ + - - 產(chǎn)氣桿菌則為- - + + （5）結(jié)果報(bào)告 完全符合以下結(jié)果：①革蘭氏陰性無芽孢桿菌；②乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣；③IMViC試驗(yàn)反應(yīng)為++--。應(yīng)判定為檢出大腸埃希菌。,吲哚試驗(yàn)（I）+

20、 -,甲基紅試驗(yàn)(M) + -,VP試驗(yàn)（Vi）+ -,枸椽酸鹽利用試驗(yàn)（C） + -,I-吲哚（indol）試驗(yàn)色氨酸→吲哚→玫瑰吲哚 ↑ 吲哚試劑,,- +,M - 甲基紅（methyl red）實(shí)驗(yàn)葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇 甲基紅 -葡萄糖→丙酮酸

21、 甲基紅 +,- +,V - VP（Voges-Proskauer）試驗(yàn),葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇 →二乙酰→紅色化合物 + 胍基化合物葡萄糖→丙酮酸 × × 乙酰甲基甲醇

22、 -,- +,,C -枸櫞酸鹽利用（citrate utilization）試驗(yàn),,利用枸櫞酸鹽生長 +不能利用 -,- +,第三節(jié) 藥物的抗菌試驗(yàn),藥物的抗菌試驗(yàn)?zāi)康氖菫榱藱z查藥物的抗菌能力，包括藥物的抑菌試驗(yàn)和殺菌試驗(yàn)。 一般先進(jìn)行體外抗菌試驗(yàn)，再進(jìn)行體內(nèi)抗菌試驗(yàn)。該項(xiàng)試驗(yàn)方法 已廣泛應(yīng)用于新

23、藥研究和指導(dǎo)臨床用藥。,(一)體外抑菌試驗(yàn),1.連續(xù)稀釋法 用于測(cè)定藥物的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC), MIC是指藥物能抑制細(xì)菌生長的最高稀釋度，以μg/ml或U/ml表示，數(shù)值愈小，藥物的抑菌作用愈強(qiáng)。（1）液體培養(yǎng)基稀釋法： 在試管中用液體培養(yǎng)基進(jìn)行2倍系列稀釋藥物→ 在每管中加等量的試驗(yàn)菌液→ 16～24h培養(yǎng)→觀察結(jié)果，以能抑制試驗(yàn)菌生長的最低濃度

24、（最高藥物稀釋度）為該藥的MIC。,液體培養(yǎng)基稀釋法藥敏試驗(yàn)的抗生素溶液稀釋方案,判斷抑菌還是殺菌，應(yīng)將未長菌的試管內(nèi)培養(yǎng)液再移種于瓊脂平板上，如重新長出試驗(yàn)菌，表明該濃度只是抑菌濃度。藥物的抑菌或殺菌作用是在一定條件下相對(duì)而言的，這與用藥時(shí)培養(yǎng)基的組成、pH及所用的菌種、菌量等因素有關(guān)，所以必須嚴(yán)格控制試驗(yàn)菌、培養(yǎng)基等試驗(yàn)條件。,液體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定藥物的最小抑菌濃度(MIC),液體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）通過平板培養(yǎng)證

25、實(shí),最小殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）,按液體培養(yǎng)基稀釋法操作測(cè)出藥物的MIC，將未長菌的各管培養(yǎng)液分別移種到無菌平板上，培養(yǎng)后以無細(xì)菌生長的最低藥物濃度（最高藥物稀釋度）作為該藥物的MBC。,（2）固體培養(yǎng)基稀釋法：1）平板法： 方法：將不同濃度的藥液按1︰9混入尚未凝固的瓊脂培養(yǎng)基中→ 制作成含有遞減濃度藥物的瓊脂平板→將定量的菌液點(diǎn)種法逐個(gè)點(diǎn)種于平板→ 37℃培養(yǎng)

26、24h → 測(cè)得各種細(xì)菌對(duì)藥物的MIC。 應(yīng)用：測(cè)定多種細(xì)菌對(duì)同一藥物的MIC； 各種藥物的抗菌活性測(cè)定； 新抗菌藥物的篩選。 優(yōu)點(diǎn)：不受藥物顏色及渾濁度的影響，且手續(xù)簡(jiǎn)便。2）斜面法： 方法：將不同遞減濃度的藥液→混入未凝固的裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管中→制成斜面→接種定量的試驗(yàn)菌液→培養(yǎng)→測(cè)知MIC （μg/ml）。 應(yīng)用：適用于必須較長時(shí)間培養(yǎng)的試驗(yàn)菌(如結(jié)核桿菌

27、)或避免孢子飛揚(yáng)污染環(huán)境的霉菌。,,2.瓊脂擴(kuò)散法 原理：是利用藥物在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散，并在一定濃度范圍內(nèi)抑制細(xì)菌生長，形成無菌生長的透明圈即為抑菌環(huán)。抑菌環(huán)的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（抑菌環(huán)越大， MIC 越?。?。 方法：在瓊脂平板上→接種（涂布法或傾注法）試驗(yàn)菌→加藥于平板上→培養(yǎng)18～24h→觀察測(cè)量抑菌環(huán)直徑，或抑菌范圍的大小→評(píng)價(jià)藥物抗菌作用的強(qiáng)弱。

28、 應(yīng)用： 用于定性試驗(yàn)； 初步判斷藥物的抗菌作用的大小。,,（1）濾紙片法： 方法：①無菌濾紙片→蘸取一定濃度的抗菌藥物→放置 于含菌平板表面。 ②將預(yù)先配制含藥的干紙片→貼在接種細(xì)菌的 平板表面。 以游標(biāo)卡尺精確量取抑菌環(huán)的直徑大小， 判斷該菌對(duì)該藥物

29、的 耐藥 （resistant,R）、 中介（intermediate,I） 敏感（susceptible,S）,,結(jié)果判斷：,,,,,,抑菌試驗(yàn),顯 示 抑 菌 環(huán),優(yōu)點(diǎn)：在1個(gè)平板上測(cè)定多種藥物對(duì)同一試驗(yàn)菌的抗菌作用 應(yīng)用：新藥的初篩試驗(yàn)，以初步判斷新藥是否具有抗菌作用 病原菌的藥物敏感試驗(yàn)，供醫(yī)生選用藥物時(shí)參

30、考 藥敏試驗(yàn)結(jié)果解釋： “耐藥”（R）：即表示測(cè)試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達(dá)到的抗菌藥物濃度所抑制，臨床治療無效； “中介”（I）：提示該細(xì)菌對(duì)常規(guī)用藥體液或組織中的藥物濃度的反應(yīng)率低于敏感株，使用高于正常給藥量有療效； “敏感”（S）：即表示測(cè)試菌可被測(cè)定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內(nèi)達(dá)到的血藥濃度所抑制。,,（2）打孔法和管碟法： 在含有試驗(yàn)菌的平板上打孔或放置管碟，然后向孔內(nèi)加入不同濃度的待測(cè)藥物