亞細(xì)胞的分離

1、免疫熒光顯微術(shù)Immunofluorescent microscope,熒光顯微鏡技術(shù)是根據(jù)標(biāo)本本身的熒光反應(yīng)物質(zhì)具有吸收由熒光源發(fā)出的激發(fā)光能而呈現(xiàn)熒光的現(xiàn)象，或利用組織及細(xì)胞內(nèi)某成分可與熒光染料結(jié)合，并受到熒光激發(fā)后呈現(xiàn)出特定顏色熒光的原理，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量和定位的技術(shù)。 免疫熒光（immunofluorescence，IF）定位是利用抗體與生物分子（抗原）的特異性結(jié)合，通過(guò)熒光結(jié)合抗

2、體對(duì)抗原的特異性標(biāo)記顯現(xiàn)圖像，從而對(duì)標(biāo)本中的抗原進(jìn)行定性、定量和定位。由于熒光與標(biāo)本黑暗的背景對(duì)比強(qiáng)烈，所以熒光顯微術(shù)的靈敏度非常高。熒光強(qiáng)度與激發(fā)光的量及熒光染料的量成線性比例關(guān)系，因此可以根據(jù)鏡下熒光強(qiáng)度對(duì)標(biāo)本中的抗原進(jìn)行定量測(cè)定。,目前，免疫熒光顯微術(shù)已廣泛應(yīng)用于研究胚胎發(fā)育、病理組織、癌癥及正常細(xì)胞表型，植物、真菌、細(xì)菌、病毒、亞細(xì)胞定位，以及抗原的輔助定位等。該技術(shù)的關(guān)鍵是抗體的特異性、標(biāo)本的制備、自身熒光、顯微鏡的使用及操

3、作者。抗體特異性取決于免疫時(shí)用的抗原的純度，使用親和純化的多克隆抗體或單克隆抗體可以獲得滿意的結(jié)果。自身熒光通常限制細(xì)胞和組織中熒光抗體探針的可檢測(cè)性。,通過(guò)光譜辨別（spectrum discrimination）可以將自身熒光的影響減至最低。光譜辨別包括選擇適當(dāng)?shù)奶结樅蜑V光器以使探針的熒光信號(hào)相對(duì)于自身熒光之比達(dá)到最大。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自身熒光物質(zhì)主要是黃素輔酶（FDA和FMN，吸收光波長(zhǎng)為450 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)

4、為515 nm）和還原型吡啶核苷酸（NADH，吸收光波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為460 nm）。 植物的自身熒光物質(zhì)常是木質(zhì)素，產(chǎn)生綠色熒光；卟啉，如葉綠素，產(chǎn)生長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅色熒光。因此，在IF中使用發(fā)射藍(lán)光的短波長(zhǎng)熒光染料比較好。對(duì)于固定細(xì)胞，在抗體孵育前先用含0.1％硼氫化鈉的PBS溶液漂洗30 min，可顯著地減低自身熒光。,1. 熒光顯微鏡及其附屬設(shè)備,熒光顯微鏡觀察是在光學(xué)顯微鏡水平上對(duì)蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞組分進(jìn)行定

5、位的最常用的方法一。熒光顯微鏡由光源、濾片和顯微鏡三個(gè)系統(tǒng)組成。（一）光源 熒光顯微鏡的光源系統(tǒng)是應(yīng)用高壓汞燈，該燈能以最小的表面積釋放出最大量的短波光源（紫外線）。由啟動(dòng)裝置控制，每次啟動(dòng)可工作2～3 h。其使用壽命與啟動(dòng)次數(shù)、工作時(shí)間密切相關(guān)，故在使用時(shí)避免頻繁啟動(dòng)而損壞電極。,（二）濾片系統(tǒng) 濾片系統(tǒng)包括激發(fā)濾片、阻斷濾片和吸熱濾片。 1．激發(fā)濾片：大多以其所表現(xiàn)的光譜基本色調(diào)

6、性質(zhì)命名。（1）UV激發(fā)濾片 激發(fā)光通常為波長(zhǎng)365～400 nm的紫外線。該濾片適于櫻草素（primulin）、硫磺素（thioflavine）、Hoechst 33258及Hoechst 33342等熒光染色觀察。（2）V干涉激發(fā)濾片：激發(fā)光為波長(zhǎng)410～420 nm的紫光。適于單胺類的熒光觀察。（3）BV激發(fā)濾片：激發(fā)光為波長(zhǎng)404～435 nm的藍(lán)紫光。適于吖啶橙及異硫氰酸熒光素（faluorescein isothio

7、cyanate, FITC）標(biāo)記抗體的免疫熒光染色觀察。（4）B干涉激發(fā)濾片：激發(fā)光為波長(zhǎng)490nm的藍(lán)光。也適于FITC標(biāo)記抗體的免疫熒光觀察。（5）G干涉激發(fā)濾片：激發(fā)光為波長(zhǎng)520～550 nm。適于四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）標(biāo)記抗體的免疫熒光染色觀察 。,2. 阻斷濾片：在光路中吸收那些經(jīng)過(guò)標(biāo)本后未被標(biāo)本轉(zhuǎn)化，吸收而射到視野的激發(fā)光，起保護(hù)觀察者眼睛的作用。激發(fā)與阻斷濾片配合使用的范圍。,3. 吸熱濾片：由于光源都含

8、有一定量的紅光而產(chǎn)生熱量，此類濾片具有吸收熱量的作用。,（三）熒光顯微鏡 熒光顯微鏡依照光路照射方向分為透射式和落射式兩種。大部分熒光顯微鏡兼有透射和落射兩種功能。通過(guò)改變光路中的反光鏡可以進(jìn)行透射光或落射光熒光觀察。,2. 抗體標(biāo)記,抗體與抗原的結(jié)合方法：直接法和間接法。直接法是將帶有標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)，顯示出抗原存在的部位。間接法是在抗體抗原初級(jí)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，再用帶標(biāo)記的次級(jí)抗體同初級(jí)抗體反應(yīng)，從而使初級(jí)反應(yīng)

9、得到放大，顯示增強(qiáng)。,圖 免疫細(xì)胞化學(xué)直接法（A）與間接法（B）示意圖,,3. 熒光染料,熒光染料是否發(fā)射熒光及熒光的強(qiáng)弱主要決定于該染料的分子結(jié)構(gòu)，同時(shí)與其所處的環(huán)境及其狀態(tài)也有密切的關(guān)系。如：染色液的pH、濃度和染色時(shí)的溫度等均對(duì)熒光效應(yīng)有一定的影響。 在進(jìn)行熒光染色時(shí)，還要注意避免與對(duì)熒光有淬滅作用的物質(zhì)接觸。例如鹵酸鹽，碘離子作用最強(qiáng)，其次為溴離子，而氯離子作用最?。唤饘匐x子，如鐵離子、銀離子等對(duì)熒光亦有淬滅作

10、用。,熒光素是免疫熒光術(shù)中最常用的熒光染料，經(jīng)紫外光（<400 nm）或藍(lán)光（常為490 nm）激發(fā)后，發(fā)射出綠色熒光（500~550 nm），其波長(zhǎng)范圍正是暗適應(yīng)時(shí)眼睛最敏感的范圍，而且顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)也能進(jìn)行最佳校準(zhǔn)。 羅丹明、伊紅、四甲基羅丹明、Texas紅也是常用的熒光染料，其激發(fā)光波長(zhǎng)為520~590 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為550~620 nm，可通過(guò)一個(gè)異硫氰酸基團(tuán)與抗體相連。 一般來(lái)說(shuō)，由于眼睛對(duì)黃光、紅光比藍(lán)光敏感

11、，所以黃色和紅色熒光染料比藍(lán)色熒光染料更有用。藍(lán)色熒光染料常需紫外線激發(fā)，還可能損傷許多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并易使細(xì)胞產(chǎn)生自發(fā)熒光。,許多熒光染料也可與毒素結(jié)合。每種毒素特異性結(jié)合一種細(xì)胞靶結(jié)構(gòu)，從而能夠顯示這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)。例如，熒光毒傘素用于標(biāo)記細(xì)胞的絲狀肌動(dòng)蛋白（F肌動(dòng)蛋白）。DAPI是用于熒光標(biāo)記雙鏈DNA最常用的熒光染料。,圖2（a）上皮細(xì)胞（b）細(xì)胞線粒體（c）肌動(dòng)蛋白（d） HeLa細(xì)胞(Alexa Fluor 546共軛毒傘素)

12、（e）非洲綠猴腎細(xì)胞肌動(dòng)蛋白（f）棕櫚樹(shù)組織,DAPI與A-T堿基結(jié)合后，其熒光比處于溶液中的自由狀態(tài)或與G-C堿基結(jié)合的熒光強(qiáng)約20倍。DAPI可用于顯示支原體污染及線粒體，但最常用于顯示細(xì)胞核和染色體。缺點(diǎn)是，在多色成像中，用360 nm的光激發(fā)時(shí)，DAPI發(fā)射的光太亮，從而掩蓋了其他的熒光信號(hào)，可改用405 nm的光作為激發(fā)光。 長(zhǎng)波長(zhǎng)的光不僅能很好地激發(fā)DNA，還可減少對(duì)細(xì)胞的損害，而且也減少對(duì)其他熒光染料的漂白作用。由于

13、DAPI有足夠的明亮度，故仍是標(biāo)準(zhǔn)的DNA熒光染料。,三、用酶標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位,（一） 原理 免疫酶標(biāo)技術(shù)（Immunoenzymatic Technique）是指用酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行抗原－抗體反應(yīng)。這種標(biāo)記物可同時(shí)保留抗體的免疫特性和酶的活性。用酶標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合后，需再滴加酶的底物過(guò)氧化氫（H2O2）和供氫體二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine terrahydrochloride，DAB）。酶和

14、底物反應(yīng)后可產(chǎn)生有色沉淀物，借助一般光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡進(jìn)行定位、定性研究，也可應(yīng)用光電比色計(jì)或酶標(biāo)儀進(jìn)行定量測(cè)定。,采用酶檢測(cè)法常遇到的問(wèn)題及解決方法（1）內(nèi)源性細(xì)胞酶活性的存在對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響：雖然細(xì)胞內(nèi)源性酶活性的問(wèn)題并不是普遍存在，但有些細(xì)胞和組織有內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶（如巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞及紅細(xì)胞）或堿性磷酸酶（如胎盤(pán)、小腸），這些內(nèi)源性酶活性的存在會(huì)給實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定帶來(lái)麻煩。,如果已知或懷疑存在內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，可以用

15、含有1％乙酸的甲醇室溫處理15 min，或用含0.03％ H2O2的甲醇室溫處理30 min。如果是經(jīng)乙醛固定過(guò)的細(xì)胞或組織，在制作光學(xué)顯微鏡標(biāo)本時(shí)，可用高碘酸－硼酸鈉處理以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性（在與一抗反應(yīng)之前，首先將標(biāo)本用0.01 mol/L。高碘酸處理10 min，隨后在0.1 mg/ml硼酸鈉溶液中孵育10 min）。標(biāo)本用緩沖液漂洗后再進(jìn)行定位檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作的其余步驟。內(nèi)源性堿性磷酸酶活性可以通過(guò)在底物混合液中加入左旋咪唑來(lái)

16、加以封閉。,（2）對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果模棱兩可：如果對(duì)過(guò)氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)物判斷不清，可以在DAB底物溶液中加入鎳或鈷等金屬鹽，會(huì)使反應(yīng)更為敏感，此時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物呈紫色或黑色。首先用水配制8％ NiCl2貯存液，再按每0.5 ml DAB溶液（0.5 mg/m1）加入4 µL 8％ NiCl2貯存液進(jìn)行孵育，最后加3 µL 2％ H202使反應(yīng)進(jìn)行。,（二）材料 包括22 mm×25 mm的1.

17、5號(hào)蓋玻片、35 mm的培養(yǎng)皿或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、2％甲醛、戊二醛、PBS、0.3 mol/L甘氨酸、0.5 mg/ml硼酸鈉、l0％TritonX-100貯存液、正常血清、一抗、二抗（根據(jù)自己的需要選定）、0.05 mol/L Tris-HCl（pH 7.6）、DAB顯色劑、BCIP/NBT顯色劑、20 mmol/L EDTA。 緩沖液l：含150 mmol/L NaCl、 l00 mmol/L Tris-HCl，用NaOH或HCl

18、調(diào)pH為7.5。 緩沖液2：含l00 mmol/L Tris-HCl（pH 9.5）、100 mmol/L NaCl、50 mmol/L MgCl2。,（三）方法 1．過(guò)氧化物酶偶聯(lián)抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位（1）在35 mm的培養(yǎng)皿或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的一個(gè)孔中放入一張蓋玻片（22 mm×25 mm），在蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞在蓋玻片上鋪滿50-70％是最理想的狀態(tài)，但具體情況應(yīng)視實(shí)驗(yàn)研究決定。 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞可通過(guò)細(xì)

19、胞離心涂片器（Cytospin，Shandon Lipshaw）或用多聚L賴氨酸包被蓋玻片來(lái)使其黏附在蓋玻片上。,（2）用2％甲醛加0％、0.01％、0.1％、0.25％或0.5％戊二醛-PBS溶液（pH 7.4）固定細(xì)胞，室溫下放置20 min。 用不含戊二醛的甲醛固定后，大部分抗原能夠很容易地被定位。這樣固定可滿足光學(xué)顯微鏡檢測(cè)，且通常可作為電鏡定位的一種良好的陽(yáng)性對(duì)照。但有些抗原會(huì)由于固定不充分而丟失，遇到這種情

20、況時(shí)就需在固定混合液中加人一些戊二醛，并需通過(guò)滴定來(lái)確定戊二醛的最適濃度。由于不同的抗原對(duì)戊二醛的敏感性不同，因此需要嘗試一系列濃度的戊二醛，從中確定出能保存免疫反應(yīng)性的最高濃度。,（3）用0.3 mol/L甘氨酸或含有0.5 mg/ml硼酸鈉的PBS洗細(xì)胞3次，每次10 min，以減少游離的醛類。（4）按所需的終體積用PBS將10％ Triton X-100貯存液稀釋成0.5％的溶液。由于Triton X-100非常黏稠，這樣做可使

21、這種去污劑溶液的最終濃度更恒定一些。用0.5％ Triton X-100 + 0.5％ NGS-PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化處理，冰浴作用5 min。（5）用產(chǎn)生二抗的動(dòng)物正常血清封閉試劑，室溫封閉10 min。（6）用PBS+1％NGS洗3次，每次10 min。（7）加入一抗，室溫孵育1 h。,（8）用PBS+1％NGS洗3次，每次10 min。（9）用1:50稀釋的過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（用親和層析純化）室溫孵育1 h，反應(yīng)在潮濕倉(cāng)里

22、進(jìn)行。（10）用PBS洗3次，每次10 min。（11）用0.05 mol/L Tris-HCl（pH 7.6）洗2次，每次l0 min。（12）放人DAB+H202中孵育，直到形成足夠滿意的反應(yīng)產(chǎn)物。 配制DAB時(shí)首先用0.05 mol/L Tris-HCl（pH 7.6）將其溶解成1 mg/ml，然后用Tris-H202 [15 ml Tris-HCl（pH 7.6）+10 µL 30％ H202]稀釋成0.5 m