lm臨床班血液分析儀及其臨床應用

1、網織紅細胞計數 紅細胞沉降率測定血液分析儀及其臨床應用,第二章 血液一般檢驗（三） BLOOD ROUTINE TEST,武漢科技大學天佑醫(yī)院檢驗科李 明,,網織紅細胞(reticulocyte，Ret)是晚幼紅細胞脫核后到完全成熟紅細胞間的過渡細胞，晚幼紅脫核后，胞質內含有殘存的RNA/DNA等嗜堿性物質，在煌焦油藍或新亞甲藍活體染色時，呈現(xiàn)出淺藍或深藍色網織狀。 屬于尚未完全成熟的紅細胞(當嗜堿性物質消耗殆盡后才

2、被視為成熟紅細胞)，一般為8～9.5μm。,網織紅細胞計數,,【質量保證】 以手工計數法為重點。 1．染料選擇,【質量保證】 2．正確辨認網織紅細胞 外周血中網織紅細胞主要為Ⅳ型，凡含有2個以上網織顆粒的紅細胞均應計為網織紅細胞。 3．網織紅細胞計數方法 (1)Miller窺盤： (2)顯微成像系統(tǒng)：計算機和細胞形態(tài)分析軟件， ①HFR：粗顆粒堆積成網狀。 ②MFR：粗顆粒在10個以上，或細小顆粒超過

3、15個。 ③LFR：細胞內含15個以下細小顆粒,①網織紅細胞百分數： 成人和兒童:0.005～0.015 新生兒: 0.02～0.06②網織紅細胞絕對數： 成人和兒童: (24～84)X109／L,參考值,臨床意義,1．評價骨髓增生能力，判斷貧血類型。 (1)網織紅細胞增多：表示骨髓造血功能旺盛，各種增生性貧血（HA、IDA及巨幼貧）及失血性貧血；某些貧血治療的恢復期明顯增多，如IDA補充鐵劑后。

4、 (2)網織紅細胞減少：常見于再生障礙性貧血(AA) (3)鑒別貧血：,臨床意義,2．評價療效 (1)觀察貧血療效：貧血隨訪 缺鐵貧或巨幼貧有效治療后，2～3d后Ret開始上升，7～10d達到最高峰(約10％)，2周后漸降至正常。 (2)骨髓移植后監(jiān)測骨髓造血恢復： 骨髓移植后第21天，如Ret大于15X109／L，常表示無移植并發(fā)癥； 若骨髓開始恢復造血功能，首先HFR和MFR上升，其次為網織紅細胞計數值上升

5、。,臨床意義,3．放療和化療的監(jiān)測 指導臨床適時調整治療方案，避免造成嚴重的骨髓抑制。機體接受放、化療后，如出現(xiàn)骨髓抑制，早期HFR和MFR降低，而后網織紅細胞數值降低；停止放、化療，骨髓功能恢復后，這些指標依次上升。,,臨床意義,紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)簡稱血沉，指在規(guī)定條件下，離體抗凝全血中的紅細胞自然下沉的速率。 血沉過程一般分為3期：①緡錢狀紅細胞形成期，

6、一般要經過數分鐘至10min。②快速沉降期，形成緡錢狀紅細胞以等速下降，約40min。 ③細胞堆積期，又稱緩慢沉積期或擠緊期，此時紅細胞堆積在試管底部。,紅細胞沉降率測定,[檢測原理]1．魏氏法(Westergren法) 將離體抗凝血液置于特制刻度測定管內，垂直立于室溫中，記錄1h時紅細胞層下沉的距離(上層血漿的高度 )，用毫米(mm)數值報告。,[檢測原理]2．血沉儀法 血液經抗凝靜置后，紅細胞下降，

7、紅細胞與血漿分離，其界面隨時間而下移，血沉儀用發(fā)光二極管和光電管檢測此界面的透光度改變，得到血沉值并顯示紅細胞沉降高度H與對應時間t相關的H—t曲線。,[方法學評價] 1．手工法 魏氏法：為傳統(tǒng)方法，為國內規(guī)范方法 . EDTA或枸櫞酸鈉抗凝血液標本充分混合后，吸入魏氏血沉管200mm刻度處，將血沉管垂直室溫放置至少60min，應避免振動、風吹、陽光直射，然后讀取柱中紅細胞沉淀上透明血漿層約lmm處結果。IC

8、SH方法: 參考方法, 用于驗證其他方法的可靠性。,,,[方法學評價]2．儀器法 血沉儀可動態(tài)記錄整個血沉過程的變化，描繪出紅細胞沉降的曲線， ESR測定在30min或lmin內得到檢測結果，大大縮短了臨床等候報告的時間。,,[質量保證] 紅細胞數量、表面積、厚度、直徑、血紅蛋白量和血漿中各種蛋白比例。影響紅細胞緡錢狀形成的主要因素有： 1.血漿中各種蛋白的比例，與總蛋白濃度無關。清蛋白帶負電荷，球蛋白與

9、纖維蛋白原帶正電荷，紅細胞因唾液酸而帶負電荷，彼此排斥。 促緡錢狀聚集的物質：纖維蛋白原＞γ球蛋白＞αβ球蛋白、膽固醇、甘油三酯等； 清蛋白及卵磷脂則抑制紅細胞緡錢狀的形成。,3．血沉管與血沉架 血沉管與血沉架規(guī)格必須符合標準。血沉管置血沉架上應完全垂直，傾斜時，會加速沉降。4.血標本 避免脂肪血；抗凝劑濃度增加使血沉減慢，每周配制1次，置冰箱血與抗凝劑比例要準確。抽血應在30s內完成，不得混入消毒劑，避

10、免形成凝塊。,5．溫度 18～25℃的室溫下測定。室溫過高時血沉加快，可以按溫度系數校正。 6．其他 注射器、試管、血沉管要干燥潔凈，以避免溶血。7．及時測定 采血后應盡快進行測定，室溫下，標本置放時間不應超過4h，置4℃冰箱時枸櫞酸鈉抗凝血可6h, EDTA抗凝血可24h. 。,[質量保證],[參考值]①50歲：男性85歲：男性< 30mm／h,女性< 42mm／h。④兒童< 10mm／h。,血沉是較

11、為常用而缺乏特異性的試驗， 對判斷機體有無感染、組織損傷、壞死或某些疾病有無活動、進展、惡化及腫瘤浸潤、播散、轉移等都有一定的價值。 血沉測定常作為疾病是否活動的監(jiān)測指標。,臨床意義,1．血沉增快(1)生理性：女性高于男性。婦女月經期由于子宮內膜破損及出血，血沉略有增快；妊娠3個月以上可因生理性貧血及血漿纖維蛋白原增加使血沉增快；老年人，特別是70歲以上的高齡者，多因纖維蛋白原增高而血沉增快。,臨床意義,(2)病理性

12、 1)各種炎癥：感染是血沉加快最常見的原因。 急性細菌性炎癥時，由于血中急性時相反應蛋白增多，包括α1胰蛋白酶、α2巨球蛋白、C反應蛋白、轉鐵蛋白、纖維蛋白原等。在炎癥發(fā)生后2～3d可出現(xiàn)血沉增快； 慢性炎癥，如結核病、結締組織炎癥、風濕熱等，于活動期常見血沉增快，病情好轉時血沉減慢，非活動期血沉可正常。,2)組織損傷及壞死： 范圍較大的組織損傷或手術創(chuàng)傷常致血沉增快，若無合并癥，一般2～3周內恢復正常；

13、 心肌梗死時，于發(fā)病后3～4d可見血沉增快(急性時相反應蛋白)，并持續(xù)1～ 3周，而心絞痛時血沉多正常。,3)惡性腫瘤： 血沉可作為惡性腫瘤的普查篩選的輔助指標， 通常迅速增長的惡性腫瘤血沉均增快，良性腫瘤血沉多正常。 惡性腫瘤手術切除后或治療較徹底，血沉可趨于正常，復發(fā)或轉移時又可增快。,4)高球蛋白血癥： 多種因素導致的免疫球蛋白增高可見血沉增快，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、惡性

14、淋巴瘤、亞急性感染性心內膜炎、肝硬化、慢性腎炎等。 高粘滯性綜合征時，血沉可不增快甚至減慢。,5)貧血：貧血患者血紅蛋白低于90g／L時，血沉可輕度增快，并隨貧血加重而增快。6)高膽固醇血癥：如動脈粥樣硬化、糖尿病、腎病綜合征、粘液性水腫、原發(fā)性家族性高膽固醇血癥等，血沉常常增快。,2．血沉減慢 一般臨床意義較小，主要見于真紅、低纖維蛋白原血癥、充血性心力衰竭、紅細胞形態(tài)異常(如異形紅細胞、球形紅細胞、鐮形紅細胞

15、)。,血液分析儀及其臨床應用,hematology analyzer and clinical application,血液分析儀及其臨床應用,發(fā)展簡史檢測原理(庫爾特原理)血液細胞分析儀（三分類法）原理 及臨床應用（細胞直方圖的形成）血液細胞分析儀的發(fā)展（五分類法）,一、發(fā)展簡史,1590 年荷蘭人米德爾堡和詹森設計制造了最原始的顯微鏡（圖1） 1610 年伽利略使用望遠鏡觀察小的物體并將其放大，后來被列文霍克改進成為

16、原始的顯微鏡。 1658 年意大利人馬爾皮基應用最原始的顯微鏡首先觀察到了紅細胞，他是第一個見到紅細胞的人，開始進行紅細胞計數則是200 年后的事情了。 1855年發(fā)明了計數血細胞的計數板（Neubauer計數板）一直沿用至今。 而設計并生產出第一臺血細胞計數儀則又過了近100 年。,最初的血細胞計數儀是一種單參數測定儀器，只能對血液中的紅細胞和白細胞進行計數，并且需人工切換。最早生產的血球計數儀為Coulter 型

17、1958 年以Coulter 命名的專門從事顆粒性測量計數的儀器公司，庫爾特電子（Coulterlectronics ）公司成立。,血液分析儀發(fā)明者庫爾特先生,35歲的美國人庫爾特發(fā)明了粒子計數技術；50年代初期，血細胞計數儀開始應用于臨床?？萍紴槿祟惤】捣?，熱心社會公益事業(yè)。,庫爾特先生1913-1998,此后，歐洲、日本也開始了血液細胞計數儀的開發(fā)和研制,我國在60年代中期也開始了這種儀器的開發(fā)和生產。 我國1965年

18、在上海也生產了簡單的血細胞計數儀，1975 年北京醫(yī)療儀器廠也開始模仿設計自己的簡單的紅白細胞計數儀。 血細胞計數儀（Blood Cell Counter） 血液細胞分析儀(Hematology Analyzer),,血液分析儀,二、檢測原理,庫爾特原理 庫爾特原理是利用電阻抗法測量細胞的數量和體積。其內容為：血細胞是電的不良導體，通過電場（計數小孔）時產生電阻， 將電阻變化轉化成脈沖信號，

19、感應器通過檢測脈沖的數量及大小，從而計算出通過小孔的細胞數量及體積。（血細胞計數和分析中最為經典的原理）,三、三分類法原理及臨床應用,（一）三分類法(體積分類法）原理 各種單純電阻法血細胞分析儀的原理即為電阻抗（庫爾特原理）原理。,血細胞直方圖概念： 在細胞通過小孔計數時，感應器收集脈沖的大小及數量，轉換為相應的細胞體積和數量，并在坐標上表示出來。坐標的橫軸(X)代表體積(FL)，縱軸(Y)代表相對數量，將各點用光滑的曲

20、線相連，就是直方圖。即直方圖是可以表示出細胞群體體積分布情況的圖形。,細胞直方圖作用,為臨床提供直觀的檢驗結果。為檢驗人員監(jiān)控儀器工作狀態(tài)及檢測 結果提供了直觀的圖形。注意：不同類型儀器直方圖的圖形也有差異。,（二）各種直方圖的臨床應用 1、白細胞直方圖及其臨床應用 白細胞直方圖原理： 經過特殊溶血劑處理的白細胞，可將特定的細胞群進行處理，使得絕大多數淋巴細胞體積縮小，使得中性粒細胞體積適當增大。因此在白細胞

21、分布直方圖上出現(xiàn)兩個明顯的細胞分布峰。,在三分類血細胞分析儀上，白細胞直方圖形態(tài)為“兩峰一谷”： ①小細胞區(qū)（35~90fl）：主要為淋巴細胞，包括成熟淋巴細胞以及異性淋巴細胞。 ②中間細胞區(qū)（90~160fl）：包括成熟單核細胞、嗜酸細胞、嗜堿細胞以及原始和幼稚細胞。 ③大細胞區(qū)（160~450fl）：代表成熟中性粒細胞。,白細胞直方圖的變化，可評價血液中白細胞群體的變化，但這種變化的細胞圖并無特異性，某一類白細胞的

22、增多或減低均可使直方圖產生相似的變化。 因此，異常白細胞直方圖只能提示白細 胞分群之間比例變化或可能出現(xiàn)異常細胞，故要求用顯微鏡復查血涂片。,典型病例介紹,急性淋巴細胞白血病,急性淋巴細胞白血病,慢性淋巴細胞白血病,急性粒細胞白血?。瑼ML-M3,嗜堿粒細胞白血病,嗜酸粒細胞增多癥,慢性粒細胞白血病,慢性粒細胞白血病,慢性粒單細胞白血病,單核細胞增多癥,粒細胞增多,2、紅細胞直方圖及其臨床應用,在36-360fl范圍內分析紅

23、細胞，正常紅細胞主要分布在50-200fl。 正常直方圖上可見兩個細胞群體：50-125fl區(qū)域有一個幾乎兩側對稱、較狹窄的正態(tài)分布曲線；主峰右側約在125-200fl區(qū)域的細胞，為大紅細胞和網織紅細胞。其中曲線峰頂對應的是MCV,而曲線基底的寬度大致反應RDW。,直方圖的臨床應用,紅細胞直方圖在貧血中的應用 不同貧血紅細胞體積的變化，使紅細胞 體積分布圖形發(fā)生變化，結合其它參數對 鑒別診斷頗有價值

24、（根據MCV和RDW可對貧血進行分類）： 1. 小細胞性貧血 2. 大細胞性貧血 3. 正細胞性貧血,紅細胞直方圖有關的兩個參數,紅細胞直方圖有關兩個參數是MCV，RDW 1、MCV表示紅細胞平均體積， MCV變大，紅細胞峰右移； MCV變小，紅細胞峰左移。,2、RDW,RDW由血細胞分析儀測量獲得，是反映周圍血紅細胞體積異質性的參數，它的

25、統(tǒng)計學實質是紅細胞大小的變異系數(CV)。當紅細胞通過小孔的一瞬間，計數電路得到一個相應大小的脈沖，不同大小的脈沖信號分別貯存在儀器內裝計算機的不同通道，計算出相應的體積及細胞數，統(tǒng)計處理而得RDW。在MCV相似的情況下，RDW越大，紅細胞峰就 越寬。,,小細胞性貧血,,（1）RDW輕度↑（2）RDW正常,小細胞性貧血,,RDW明顯↑也見于IDA治療有效時,大細胞性貧血（RDW正常）,見于溶貧白血病前期再障巨幼貧,大細

26、胞性貧血（RDW輕度↑）,,見于葉酸，維生素B12缺乏引起的巨幼貧,大細胞性貧血（RDW明顯↑）,見于巨幼貧葉酸，維生素B12治療初期,正細胞性貧血（RDW正常）,見于慢性病急性失血骨髓纖維化骨髓發(fā)育不良,血小板體積范圍在2fl－30fl之間，平均體積為6－7fl，所以血小板直方圖是一個偏態(tài)曲線。,3、血小板直方圖及其臨床應用,（一）血小板直方圖的臨床應用 由于紅細胞與血小板的檢測在同一通道， 小紅細胞和細胞碎片，

27、血小板自身的聚集對血小板計數及平均血小板體積的影響很大，血小板直方圖能反映這些變化，可根據圖形的變化，了解血小板計數的準確性。,所以認真分析血小板直方圖的變化，找出干擾直方圖的原因，不僅有利于疾病的診斷，而且可以甄別血小板計數的正確性。 有些儀器專門設置了增加血小板準確性的技術，如鞘流技術、浮動界標、擬合曲線等。,異常血小板直方圖,峰右移,左右側起點較高,異常血小板直方圖,右側呈脫尾狀,峰左移,其他計數原理的血細胞分析儀,1. 激

28、光法：應用單束激光照射到經過鞘流技術處理的排列成一列的單個細胞上，根據細胞阻斷激光束的頻率以及PMT收集到的激光折射信號，對細胞的數量、體積進行分析的儀器。,其他計數原理的血細胞分析儀,2. 離心式血液分析儀：將血液充入到含義特殊試劑的毛細管內，在專用離心機上離心，根據血細胞中各種成份的比重不同而分布在不同的細胞層內的原理，血細胞被吖啶橙染色，各細胞層會有明顯的顏色差異，然后將毛細管放在特殊的判讀機上對不同的細胞層進行定量分析.3.

29、移動光學法：早期的光學法血細胞計數儀器， 采用普通光源，血細胞在移動過程中被檢測到，不能分析細胞的大小和內部結結構，因此僅可進行紅細胞和白細胞的計數,四、白細胞五分類法,進入90年代中期以來，國外許多廠家已經不滿足于三分類型的血細胞分析儀，逐步開始研制和推出具有五分類或更多項白細胞分析技術的全自動型血液分析儀器，比較著名的廠家有：Coulter、Sysmex、ABBOTT、Bayer、ABX等。各廠家使用的白細胞分類技術多樣化，復雜化，

30、使得白細胞分類技術更加成熟和可靠。而技術的提高也帶來了儀器和消耗品（試劑）價格的增加。,具有白細胞五分類功能的血細胞分析儀器是指：通過各種物理和化學技術對白細胞進行分析，以獲得外周血液中白細胞的五種常見類型的百分率和絕對值的測定結果，此外還應該具有對出現(xiàn)異常白細胞的提示和初步分類功能。,五分類法原理,（一）五分類VCS技術,運用V、C、S三種探針,在流式通道的某一位點,對通過的單列白細胞，進行逐個的、同時的、三重的檢測，以及三維分析,以

31、確定其亞群性質。V-低頻波，分析細胞體積；C-高頻波，分析細胞核型；S-激光，分析細胞的顆粒特性。,接近原態(tài)的WBC分析,接近原態(tài)的白細胞,,,進入流式通道,VCS檢測,八千多個白細胞逐個、直接、同時地在流式通道內接受VCS三重檢測，得到各自的三維座標值,VCS,,,,十余種異常細胞的報警提示,VCS法白細胞分類散點圖,（二）細胞化學技術：核酸熒光染色,區(qū)別于酸堿染色、酶染色、糖原染色核酸染色物質（熒光物質）

32、Polymethine （聚次甲基）Oxazine (口惡嗪）不同的細胞亞群、不同的成熟階段，其核酸的含量，核酸的結構，DNA/RNA的比例不同，表現(xiàn)不同的著色性。與半導體激光有很好的適配性，633nm激發(fā)熒光,流式通道和光路系統(tǒng),,半導體激光器 (?=633nm),雙色分光鏡,光電倍增管（熒光信號）,流動室,光電倍增管（側向散射光信號）,光電二極管（前向散射光信號）,核酸染色和信號分析,血細胞分析儀的發(fā)展近況和展望

33、,1、血常規(guī)檢驗多參數化 2、多功能合成擴展 3、檢測速度的提高 4、方法的改進和進展 5、應用的方便性,注意：病理因素對血液分析儀使用的影響,1. 嚴重黃疸或脂血使血紅蛋白結果假性增高。2. 血液中白細胞顯著增高而影響紅細胞數。3. 有核紅細胞出現(xiàn)而影響白細胞計數。4. 某些新生兒或某些肝病病人紅細胞膜質類 異常，抗溶血劑作用，紅細胞溶解不完全 而使白細胞和血小板計數偏高。,5. 多發(fā)性骨髓瘤的M蛋白增多時，M

34、蛋白可與溶血劑發(fā)生反應，紅細胞溶解不完全而使白細胞和血小板計數偏高。6. 各種疾病引起的血栓前狀態(tài)使血小板易于聚集，使血小板計數結果假性減低。7. 紅細胞冷凝集可使紅細胞結果假性減低， 白細胞假性增高(電阻抗法)和MCV假性增高。,結束語,目前血細胞分析儀越來越普遍的應用于各級醫(yī)院的常規(guī)作中，但是并不是說所有的結果都是準確無誤的，目前在血細胞形態(tài)學方面，無論是五分類還是更多的分類，甚至是具有專門幼稚細胞分析通道的儀器，仍然不能

35、根本解決血液細胞形態(tài)學的問題，仍然不能完全以儀器分類結果徹底取代人工分類。此外儀器一些固有的產生誤差的因素還沒有徹底解決，某些影響儀器計數準確性的個別因素還存在，或某些儀器具有設計上的缺陷和應用上的局限性，因此無論是細胞計數還是多種參數的分析結果仍然會有問題發(fā)生。不要總是相信儀器，要認真對待每個實驗樣品和結果，分析判斷這個結果，檢驗工作者要對儀器的性能，質量控制，局限性，常出現(xiàn)的故障，特別對直方圖和五分類的散點圖有深刻的了解，善于發(fā)現(xiàn)問

36、題和解決問題。這一切都有待于通過人們在熟練掌握儀器的性能和不斷提高的自己的知識水平上，通過扎實的的顯微鏡下對血細胞形態(tài)學認知的基本功來解決問題。,面對問題時，如何解釋？,一個實驗室醫(yī)學工作者沒有與臨床溝通和對話的能力是不能生存的,思考題,1.手工顯微鏡計數紅細胞已不常用，但為什么 仍不能被淘汰？2.簡述細胞直方圖的定義與作用。 3.簡述Ret的定義及其臨床意義。4.怎樣理解Ret用于臨床鑒別三種常見貧血類型的思路？5.簡述