生化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完美版

1、2010級(jí)本科分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),案例： 患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日出現(xiàn)惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色蒼白。據(jù)家長反映，患者的姐姐也曾發(fā)生過類似情況。 體格檢查：體溫38℃(37.2 ℃ ），脈搏150次/分（75次/ 分），呼吸40次/分（20次/分），血壓80/60mmHg（100~120/ 60~80mmHg ），呼吸急促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏膜黃染，體型較

2、同齡人瘦小。心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無叩擊痛，神經(jīng)系統(tǒng)檢查未及異常。,實(shí)驗(yàn)室檢查： 紅細(xì)胞 1.98×1012/L(新生兒:6.0×1012/L)血紅蛋白 53g/L(兒童：110~160g/L)血清總膽紅 85.5µmol/L（3.4~11.7µmol/L）結(jié)合膽紅素 13.7µmol/L未結(jié)合膽紅素71.8µmol/L尿蛋白（++） 潛血(+

3、) 尿膽紅素(－) 尿膽素原(+) 尿液鏡下未見紅細(xì)胞,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥（俗稱“蠶豆病”）,初步診斷,發(fā)病機(jī)理 紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）有遺傳缺陷者在食用青鮮蠶豆或接觸蠶豆花粉后皆會(huì)發(fā)生急性溶血性貧血癥——蠶豆病，致病機(jī)制尚未十分明了。已知有遺傳缺陷的敏感紅細(xì)胞，因G6PD的缺陷不能提供足夠的NADPH以維持還原型谷胱甘肽（GSH）的還原性（抗氧化作用），在遇到蠶豆中某種因子后更誘

4、發(fā)了紅細(xì)胞膜被氧化，紅細(xì)胞膜上的磷脂分子中的不飽和脂肪酸氧化生成過氧化脂質(zhì)，損害細(xì)胞膜。G-6-PD有保護(hù)正常紅細(xì)胞免遭氧化破壞的作用，新鮮蠶豆是很強(qiáng)的氧化劑，當(dāng)G-6-PD缺乏時(shí)則紅細(xì)胞被破壞而致病。,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶比值法,實(shí)驗(yàn)名稱：,,,6-磷酸葡萄糖,,,6-磷酸葡萄糖脫氫酶,NADP+,NADPH+ +H+,6-磷酸葡萄糖酸,,,NADP+,NADPH+ +H+,6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶,5-磷

5、酸核酮糖,,……,【原理】,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸。紅細(xì)胞溶解的溶血素中存在6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，可催化生成的6-磷酸葡萄糖酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為5-磷酸核糖，這兩步伴有NADP+還原為NADPH，通過NADP+ 還原為NADPH的速率與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性成比例。 由于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏雜合子的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性的范圍較寬，用以上的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性定量

6、測定方法來檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏雜合子，檢出率較低。6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶缺乏極其罕見，其濃度和活性一般較穩(wěn)定。因此在一般情況下，通過測定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡糖糖酸脫氫酶活性來計(jì)算葡萄糖-6-磷酸脫氫酶/6-磷酸葡糖糖酸脫氫酶比值，可以提高對(duì)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏雜合子的檢出率。,,,【試劑】 溶血素；1mol/LTris-鹽酸緩沖液(含5mmol/L EDTA)，pH8.0；2mmol/L NADP溶液，蒸

7、餾水，0.1mmol/L 氯化鎂溶液； 6mmol/L葡萄糖-6-磷酸溶液；6mmol/L 6-磷酸葡萄糖酸溶液?！緝x器】移液器,比色皿，紫外可見分光光度計(jì)， 1ml試管,,【操作方法】（1）溶血素制備：紅細(xì)胞酶活性測定用的溶血素為比容紅細(xì)胞1體積溶于溶液19體積中。溶血素須新鮮配制，在4℃存放不宜超過8小時(shí)。（2）酶活性測定操作：本測定系統(tǒng)包括了主要測定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性（測定1）；測定6-磷酸葡萄糖酸

8、脫氫酶活性（測定2）和測定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的總活性（測定3）3個(gè)方面。在1ml的測定系統(tǒng)中，試劑的濃度及用量及檢測步驟：一對(duì)照管為基準(zhǔn)，37℃恒溫，340nm記錄各測定管得吸光度變化（A）10分鐘。如檢查系統(tǒng)＞1ml，各試劑的用量應(yīng)該按比例增加。,【計(jì)算結(jié)果】葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性IU/(2.8×1010Ｈｂ)=〔（A/2.8）×1010〕×115.8. 式中，A為測

9、定的吸光度變化值；Hb為血紅蛋白濃度；115.8為根據(jù)本測定方法反應(yīng)體系的總量，溶血素所含紅細(xì)胞數(shù)量和NADPH的吸光系數(shù)，以每分鐘的吸光度變化酶活性計(jì)算公式換算出的系數(shù),注意事項(xiàng)操作過程中，注意試劑量的準(zhǔn)確度，保持相同的酸堿度。反應(yīng)試劑須使用前新鮮配制?！菊⒖贾怠科咸烟?6-磷酸脫氫酶/6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶比值≥0.95.若<0.95，可診斷為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏。,6-磷酸葡萄糖,,G-6-PD,6-磷酸葡

10、萄糖酸酯,NADP+,NADPH(還原型輔酶Ⅱ),,谷胱甘肽還原酶,2G-SH,,抗氧化活性,,,,,5-磷酸核糖,（多步反應(yīng)）,從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果,,（氧化型）GS-SG,,,（尿三膽）尿膽素（+）、尿膽紅素(－)、尿膽素原(+),,肝腸循環(huán)增多,膽紅素,,單核吞噬系統(tǒng)降解,血紅素,紅細(xì)胞破裂,血紅蛋白滲出,,,尿蛋白(++)(1.0g/l),,,運(yùn)氧功能障礙,溶血性貧血,,循環(huán)血量減少,,,血壓下降,脈搏加

11、快(心率加快),,,呼吸加快,,過多>34.2umol/L時(shí)，黃疸,,①血清總膽紅素↑,②結(jié)合膽紅素變化不大（水溶性大，隨尿排出）,③未結(jié)合膽紅素↑（水溶性小，不能隨尿排出，有毒）,,醬油尿,G-6-PD是紅細(xì)胞葡萄糖磷酸戊糖旁路代謝中所必須的脫氫酶，它使6-磷酸葡萄糖釋放H+，從而使輔酶Ⅱ（NADP）還原成還原型輔酶Ⅱ（NADPH）.NADPH是紅細(xì)胞抗氧化的重要物質(zhì)，它能使細(xì)胞內(nèi)的氧化型谷胱甘肽（GSSG）還原成還原型的谷胱甘

12、肽（GSH）和維持過氧化氫酶（CAT）的活性（如圖）。CAT是過氧化氫（H2O2）還原成H2O的還原酶。 GSH的重要作用是：① 保護(hù)紅細(xì)胞內(nèi)含硫氰基（-SH）的血紅蛋白、酶蛋白和膜蛋白的完整性，避免H2O2對(duì)含-SH基物質(zhì)的氧化 ② 與谷胱甘肽過氧化酶（GSHpx）共同使H2O2還原成H2O，G-6-PD缺乏時(shí)，NADPH生成不足，CAT和GSH減少，因此，當(dāng)機(jī)體受到氧化物侵害時(shí)作用產(chǎn)生的H2O2不能被及時(shí)還原成H2O，過

13、多的H2O2作用于含-SH基的血紅蛋白、膜蛋白和酶蛋白，致血紅蛋白和膜蛋白均發(fā)生氧化損傷。血紅蛋白氧化成交鐵血紅蛋白和變形珠蛋白小體，紅細(xì)胞膜的過氧化損傷則致膜脂質(zhì)和膜蛋白硫基的氧化。上述作用最終造成紅細(xì)胞膜的氧化損傷和溶血。,體型體型瘦小與該疾病是否有關(guān)，為什么？,,,核酸（DNA,RNA）受影響,,蛋白質(zhì)合成與表達(dá)受限,,營養(yǎng)不良,某些肽類激素（如甲狀腺激素，生長激素）,NADPH,,脂肪酸合成,,,瘦弱,,吞噬細(xì)胞的免疫作用,,,