糖尿病腎病腎損傷機(jī)制的研究進(jìn)展蘇寧教授

1、糖尿病腎病腎損傷機(jī)制的研究進(jìn)展 ——腎臟局部微環(huán)境淺析,蘇 寧廣州中醫(yī)藥大學(xué)西醫(yī)基礎(chǔ)公共實(shí)驗(yàn)室,題 綱,糖尿病腎病概述 臨床分期；腎臟的病理變化；腎臟功能障礙及結(jié)構(gòu)損害的基礎(chǔ) DN時(shí)腎損傷機(jī)制的研究進(jìn)展 TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) TGF-β下游因子 腎臟微環(huán)境中復(fù)雜的生物活性物質(zhì)網(wǎng)絡(luò),糖尿病腎病概述,糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是指糖尿

2、?。╠iabetes mellitus，DM）時(shí)發(fā)生的腎小球、腎小管、腎間質(zhì)和腎血管病變。近年來發(fā)現(xiàn)除糖尿病直接引起的腎臟病變外，糖尿病患者常伴發(fā)多種與糖尿病無直接關(guān)系的腎臟疾病，統(tǒng)稱為糖尿病腎臟疾?。―iabetic kidney disease，DKD），其概念范圍較DN更廣。,DN的臨床分期,根據(jù)Mogensen分類，DN五期分別是：（1）腎臟肥大，腎小球高濾過期（2）腎損害無臨床表現(xiàn)期（3）微量白蛋白尿期（4）臨床DN

3、期（5）腎衰期 DN進(jìn)程中第1、2期為臨床前期，不屬于臨床DN診斷。 病人出現(xiàn)持續(xù)微量白蛋白尿表示開始進(jìn)入DN進(jìn)展期。,DN時(shí)腎臟的病理變化,根據(jù)Mogensen分類，DN早期即可出現(xiàn)腎臟肥大，主要由于高灌注引起的腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張所致，腎臟無器質(zhì)性損害；腎臟的器質(zhì)性損害多發(fā)生于病程5年以上（即DN第2期后）的DM患者。但有人觀察了11例病程在1～4年的1型DM患者的腎穿刺標(biāo)本，電鏡下已可觀察到GBM有節(jié)段性增厚和足

4、突節(jié)段性融合。提示DN的腎臟形態(tài)損傷出現(xiàn)早于功能障礙，且進(jìn)行性加重，貫穿DN整個(gè)過程。,腎小球肥大，腎小球基底膜（glomerulus basement membrane，GBM）和腎小管基底膜（tubule basement membrane，TBM）增厚，腎小球系膜基質(zhì)增多，腎小球無細(xì)胞性結(jié)節(jié)狀硬化，腎小囊玻璃滴狀病變，腎小球毛細(xì)血管袢的纖維素樣或類脂樣帽狀病變及腎小球毛細(xì)血管微血管瘤形成。DN的主要病變是細(xì)胞外基質(zhì)增生，所以又被

5、稱為糖尿病腎小球硬化癥（Diabetic glomerulosclerosis），是糖尿病導(dǎo)致腎損傷致終末腎病的主要原因。,DN時(shí)腎臟的病理變化,動(dòng)物DN病理變化,人和嚙齒類動(dòng)物在DN病理上的相同之處是均有腎臟肥大、彌漫性和滲出性腎小球病變，GBM增厚，系膜基質(zhì)擴(kuò)張和系膜細(xì)胞增生。 腎小管上皮細(xì)胞空泡變和顆粒變性、TBM增厚、間質(zhì)纖維化及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)均與人類腎臟改變相似。但嚙齒類動(dòng)物缺乏結(jié)節(jié)性腎小球病變和出入球小動(dòng)脈的玻璃樣變。,DN

6、時(shí)腎臟功能障礙及結(jié)構(gòu)損害的基礎(chǔ),DN的腎功能障礙主要表現(xiàn)為GFR降低致代謝產(chǎn)物排泄障礙、濾過膜對(duì)大分子蛋白質(zhì)的通透性增加致大量蛋白尿產(chǎn)生。DN的腎臟結(jié)構(gòu)損害主要是基底膜增厚、系膜擴(kuò)張，繼而出現(xiàn)腎小球、腎小管、間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，功能極度減退。腎臟的功能障礙與結(jié)構(gòu)損害在DN的進(jìn)程中互為因果、相互促進(jìn)。大量研究證實(shí)，DN時(shí)腎臟功能及結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)主要是細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚及足細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能障礙。,細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚,細(xì)胞外

7、基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）成分主要為： 透明質(zhì)酸（hyaluronic，HA） 層黏連蛋白（lamminin，LN） IV型膠原(type IV collagen，IV-C) 纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）。ECM在腎小球、腎小管的過度積聚可導(dǎo)致基底膜增厚、系膜區(qū)增寬、間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎硬化。,ECM過度積聚的原因,ECM過度積聚的原因有生成增多和

8、降解減少兩方面。腎小球系膜細(xì)胞（glomerulus mesangial cell，GMC）是合成和分泌ECM的主要細(xì)胞。目前研究較多的與基質(zhì)降解有關(guān)的酶是基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）。MMPs由系膜細(xì)胞、濾過膜內(nèi)皮細(xì)胞及腎小囊壁層上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞等合成和分泌，以非活性酶的形式存在于細(xì)胞周圍。,足細(xì)胞的變化,腎小球臟層上皮細(xì)胞又稱足細(xì)胞(Podocyte)，是

9、一種終末分化多突狀細(xì)胞，通過足突固定在基底膜上。兩相鄰足突間的裂隙稱為裂隙孔，其上有裂隙隔膜，構(gòu)成腎小球阻擋血漿大分子物質(zhì)濾過的孔徑屏障。足細(xì)胞表面覆蓋著由涎酸及硫酸蛋白多糖所組成的陰離子衣，是腎小球電荷屏障重要組成部分。DN時(shí)足細(xì)胞的損傷形式包括數(shù)量減少、密度減低、足突扁平融合、以及足細(xì)胞上各蛋白表達(dá)的異常，進(jìn)而破壞足細(xì)胞孔徑屏障及電荷屏障，導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生、腎小球硬化。,造成DN發(fā)生與發(fā)展的因素較為復(fù)雜，主要分為遺傳因素和非遺傳因素

10、。遺傳因素主要與基因多態(tài)性相關(guān)。非遺傳因素包括代謝、血流動(dòng)力學(xué)以及相關(guān)細(xì)胞因子的異常變化。,DN時(shí)腎損傷機(jī)制的研究進(jìn)展,氧化應(yīng)激狀態(tài)、局部炎癥改變、腎素血管緊張素系統(tǒng)、血管緊張素與蛋白激酶的相互作用,腎臟局部微環(huán)境中的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò),幾乎所有腎臟固有細(xì)胞，包括系膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，均具有產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力，并且同時(shí)又是細(xì)胞因子生物學(xué)作用的靶細(xì)胞。組織細(xì)胞，包括腎臟細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子主要通過旁分泌或自分泌形式在其生成的微環(huán)境

11、中直接發(fā)揮作用，但在某些情況下也可進(jìn)入循環(huán)，引起全身性效應(yīng)。大量研究顯示，糖尿病的高血糖狀態(tài)可激活腎臟許多局部細(xì)胞因子，目前的研究發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)與DN的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，其中以TGF-β為復(fù)雜細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的中心因子。,TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)最早是由Delaro和Todaro于1978年在研究病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞過程中發(fā)現(xiàn)的，哺乳動(dòng)物主要有TGF-β1、2、

12、3三種形式。腎臟TGF-β1表達(dá)最多，主要在腎小管上皮和腎小球。TGF-β受體(TβR)有5種不同類型(Ⅰ-Ⅴ型)，其中Ⅰ、Ⅱ兩型受體的胞質(zhì)區(qū)段有絲/蘇氨酸激酶活性，與受體后細(xì)胞內(nèi)通訊有關(guān)。大量實(shí)驗(yàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病病人和實(shí)驗(yàn)型糖尿病動(dòng)物的腎臟、血液和尿中TGF-β水平均升高。DN時(shí)腎臟GMC合成TGF-β1增多已基本成定論，同時(shí)認(rèn)為糖尿病早期的腎小球肥大是TGF-β1介導(dǎo)的。,TGF-β在DN進(jìn)程中的主要作用,TGF-β通過受

13、體信號(hào)傳遞發(fā)揮以下生物學(xué)作用：①調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化。TGF-β抑制大多數(shù)腎細(xì)胞（如腎近曲小管上皮細(xì)胞、腎小球臟層上皮細(xì)胞和腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞）的增殖和分化，對(duì)于來源于間質(zhì)的細(xì)胞（如系膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞）能同時(shí)產(chǎn)生促進(jìn)作用或抑制作用。此外，TGF-β還可以通過增大細(xì)胞直徑造成細(xì)胞肥大。②增加ECM蛋白含量。TGF-β可增加Ⅰ、Ⅲ、IV型膠原、FN和蛋白多糖的合成，并抑制其降解。③參與炎性反應(yīng)、組織修復(fù)、胚胎發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)過程。,

14、TGF-β/Smads信號(hào)通路的激活,TGF-β與受體TβR結(jié)合后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與一組信號(hào)蛋白Smad蛋白有關(guān)。Smad蛋白是目前所知TGF-β受體的胞內(nèi)激酶底物，介導(dǎo)了TGF-β的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前，在哺乳動(dòng)物已分離鑒定的Smad蛋白有9種（Smad1-9），Smad2、3參與TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)，Smad4是TGF-β家族各類信號(hào)傳導(dǎo)過程中共同需要的介質(zhì)。DM時(shí)腎臟存在著TGF-β/Smads信號(hào)通路的激活。高糖可能是引起TGF-β/S

15、mads信號(hào)通路激活的原因之一。,TGF-β/Smads信號(hào)通路對(duì)ECM合成及降解的影響,TGF-β可促進(jìn)ECM各蛋白成分合成并阻止其降解。TGF-β可通過Smads信號(hào)通路刺激多種基質(zhì)蛋白的基因表達(dá)。TGF-β可通過阻止MMPs的合成和刺激TIMPs的產(chǎn)生來阻止基質(zhì)降解。,TGF-β/Smads信號(hào)通路介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的作用,體內(nèi)和體外研究均發(fā)現(xiàn)TGF-β可通過激活p38MAPK和上調(diào)Smad7來誘導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡。p38MAPK被激

16、活后可使哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶caspase-3活性增加，而Smad7可通過抑制抗凋亡因子NF-κB的活性來加強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡作用。,,TGF-β下游因子——結(jié)締組織生長(zhǎng)因子,結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）通過免疫組化技術(shù)在正常大鼠和人腎小球檢測(cè)不到，在DN時(shí)表達(dá)上調(diào)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，db/db大鼠的GMC在暴露于TGF-β、高糖等情況下，明顯誘導(dǎo)CTGFmRNA表

17、達(dá)增加。腎近端小管上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)TGF-β能誘導(dǎo)CTGF合成，且抗CTGF抗體及CTGF反義寡聚脫氧核苷酸均能抑制TGF-β誘導(dǎo)的ECM蛋白合成。故有人認(rèn)為CTGF與TGF-β的關(guān)系密切，CTGF是TGF-β的下游分子，在促進(jìn)腎臟纖維化中具有重要作用。,TGF-β下游因子——結(jié)締組織生長(zhǎng)因子,CTGF通過自分泌、旁分泌途徑發(fā)揮以下生物學(xué)功能：①促進(jìn)細(xì)胞趨化、增殖。CTGF能促進(jìn)間質(zhì)來源細(xì)胞(間質(zhì)成纖維細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞)從G0期進(jìn)入

18、G1期，但阻止細(xì)胞從G1期過渡到S期，且對(duì)成纖維細(xì)胞有強(qiáng)烈的趨化作用，從而導(dǎo)致系膜區(qū)細(xì)胞增殖和成纖維細(xì)胞積聚。②提高ECM含量，誘導(dǎo)基質(zhì)沉積。CTGF能促進(jìn)多種ECM蛋白成分如Ⅰ型、Ⅲ型、IV型膠原和FN的合成，促進(jìn)α5整合素表達(dá)而增強(qiáng)細(xì)胞與基質(zhì)相互作用，促使TGF-β以無活性的前體蛋白形式分泌而擴(kuò)大上述效應(yīng)。CTGF的眾多生物學(xué)作用類似于TGF-β。,血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，P

19、DGF）B鏈被認(rèn)為是TGF-β的下游介質(zhì)，用可溶性PDGF-B受體阻滯劑可以減少系膜細(xì)胞增生和ECM沉積。糖尿病時(shí)，葡萄糖在早期引起TGF-β1轉(zhuǎn)錄升高是通過p38MAP激酶活化，另外，葡萄糖引起PDGF-B依賴性TGF-β1翻譯水平升高，是通過增加細(xì)胞內(nèi)PDGF的敏感性完成。這解釋了臨床上血糖控制不好的糖尿病患者可導(dǎo)致DN的進(jìn)行性發(fā)展的現(xiàn)象。,TGF-β下游因子——血小板源性生長(zhǎng)因子B鏈,,DN時(shí)腎臟微環(huán)境中復(fù)雜的生物活性物質(zhì)網(wǎng)絡(luò),細(xì)

20、胞因子網(wǎng)絡(luò) 蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng) 腎素血管緊張素系統(tǒng)腎臟局部炎癥反應(yīng)腎臟局部氧化應(yīng)激反應(yīng),腎素血管緊張素系統(tǒng),腎素血管緊張素系統(tǒng)（renin angiotensin system，RAS）由腎素、血管緊張素Ⅰ(AngiotensinⅠ，AngⅠ)、血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶（angiotensin Ⅰ converting enzyme，ACE）、AngⅡ以及血管緊張素受體（angiotensin receptor，ATR）等成分組成。

21、對(duì)機(jī)體心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、水鹽平衡及內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)態(tài)的維持有重要作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，證實(shí)了腎組織存在其自身的RAS，通過旁分泌作用調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過、腎小管重吸收及系膜細(xì)胞增殖、收縮等功能。DN時(shí)腎臟AngⅡ活性增高,AngⅡ與TGF-β1,在DN時(shí)，異常的葡萄糖代謝是導(dǎo)致TGF-β1升高的主要因素，此外RAS亢進(jìn)使AngⅡ產(chǎn)生過多也是引起高血糖狀態(tài)下TGF-β1表達(dá)增加的另一重要因素。AngⅡ可以通過增強(qiáng)TGF-β啟動(dòng)子的活性上

22、調(diào)TGF-βmRNA的表達(dá)，通過誘導(dǎo)TGF-β1產(chǎn)生而增加ECM合成。AngⅡ不僅可以上調(diào)TGF-β1表達(dá)，還可促進(jìn)細(xì)胞新合成釋放的TGF-β1活化。,蛋白激酶C信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng),蛋白激酶C（protein kinase，PKC）是l977年Nishizuka發(fā)現(xiàn)的可被Ca2+/磷脂激活的一類絲/蘇氨酸激酶，由多種不同結(jié)構(gòu)不同生物特性的同工酶（亞型）組成。PKC各亞型在信號(hào)傳導(dǎo)和功能上有特異性，其短期效應(yīng)包括激素、神經(jīng)遞質(zhì)及細(xì)胞因子的釋放

23、，離子通道的轉(zhuǎn)運(yùn)，代謝調(diào)節(jié)，細(xì)胞收縮及免疫和炎癥反應(yīng)；長(zhǎng)期效應(yīng)包括調(diào)節(jié)基因表達(dá)，蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞增殖分化。PKC靜息狀態(tài)下主要以無活性的形式存在于胞漿中，受到外界刺激時(shí)受其特異性底物蛋白吸引自胞漿向胞膜轉(zhuǎn)移。PKC的膜轉(zhuǎn)移現(xiàn)象為PKC激活的重要標(biāo)志。,蛋白激酶C信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng),PKC的活化有多條途徑，DM時(shí)主要通過從頭合成二脂酰甘油（diacylglycerol，DAG）途徑活化PKC。DAG是體內(nèi)最主要的內(nèi)源性PKC激動(dòng)劑。DM時(shí)激

24、活的PKC通過其下游事件參與DN的發(fā)生發(fā)展：⑴磷酸化磷酯酶A2，使NO產(chǎn)生增多，擴(kuò)張血管，參與腎小球早期高濾過。⑵磷酸化肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，降低細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間連接，從而增加腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，發(fā)生蛋白尿。⑶PKC可促進(jìn)TGF-β表達(dá)上調(diào)。,AngⅡ與PKC,AngⅡ通過其受體AT1激活酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK），TK通過一系列生化途徑促使DAG激活PKC。AngⅡ激活PKC后又可以通過增加近端小管

25、重吸收葡萄糖來促進(jìn)高糖激活PKC能力。也就是說，高糖和AngⅡ?qū)KC可有協(xié)同刺激作用。,PKC與TGF-β1,PKC可使Smad2和Smad3 MH1結(jié)構(gòu)域磷酸化，而MH1結(jié)構(gòu)域是Smad與DNA直接結(jié)合的部位，這提示PKC有影響TGF-β1/Smad信號(hào)通路的作用。,核轉(zhuǎn)錄因子-κB,核轉(zhuǎn)錄因子-κB（Nuclear Factor Kappa B，NF-κB）最早于1986年Sen和Baltimore在分析B淋巴細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的

26、一種核蛋白因子，它能與免疫球蛋白κ鏈基因的內(nèi)源性增強(qiáng)子κB序列特異性結(jié)合，因而得名。NF-κB在組織細(xì)胞中廣泛存在，腎小球系膜細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入腎臟的免疫細(xì)胞都存在NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控。,核轉(zhuǎn)錄因子-κB,細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，NF-κB 與其細(xì)胞內(nèi)抑制性蛋白IκB結(jié)合形成NF-κB/IκB復(fù)合物，以非活性形式存在于細(xì)胞漿中，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外刺激后，IκB磷酸化，使NF-κB/IκB復(fù)合物解離，隨后NF-κB

27、進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特異性基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域“5-GGGRNYYCC-3”（κB序列）結(jié)合，啟動(dòng)或調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。有DNA結(jié)合活性的NF-κB都是一個(gè)二聚體，其中研究最多的是p50/p65二聚體。DN時(shí)NF-κB可被多種因素異常激活，如PKC及ROS途徑,核轉(zhuǎn)錄因子-κB,NF-κB可從分子水平調(diào)節(jié)許多信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的功能，主要包括：①介導(dǎo)炎癥反應(yīng)；NF-κB可高效誘導(dǎo)各種細(xì)胞因子（如IL-2、IL-6、INF-α）、黏附因子（ICAM-

28、1、VCAM-1）、趨化因子（MCP-1、C3），調(diào)控參與炎癥反應(yīng)放大與延續(xù)的多種酶。②參與細(xì)胞增殖和凋亡；研究發(fā)現(xiàn)[56]，細(xì)胞周期蛋白Dl（cyclin D1）啟動(dòng)子含有2個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB活化具有促進(jìn)cyclin D1表達(dá)及G1/S期轉(zhuǎn)換的功能，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，細(xì)胞表現(xiàn)為無限增殖和自主分裂。所以激活GMC中的NF-κB可明顯促進(jìn)GMC增殖。,AngⅡ與NF-κB,研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素原基因及AT1R基因的啟動(dòng)子區(qū)

29、域含有NF-κB的結(jié)合序列，提示激活后的NF-κB既可增加血管緊張素原表達(dá)、又可增加AT1R的表達(dá)，從而增加了AngⅡ-ATIR的作用，促進(jìn)了DN的發(fā)生、發(fā)展。有人推測(cè)NF-κB在DN發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制可能為：高血糖刺激使血AngⅡ濃度或活性增強(qiáng)，AngⅡ激活NF-κB，通過NF-κB的中心調(diào)控，產(chǎn)生多種免疫炎癥相關(guān)因子如巨噬細(xì)胞活化因子、MCP-1等，引起GMC增殖、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而引起蛋白尿增加及腎功能損害等表

30、現(xiàn)。,NF-κB與TGF-β1,研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的活化劑轉(zhuǎn)谷酰氨酶的前體由NF-κB調(diào)控。由此推測(cè)，腎組織中NF-κB的活化，可促使TGF-β1表達(dá)增加，導(dǎo)致ECM合成增加，在DN的過程中具有重要的作用。,PKC、NF-κB與局部炎癥反應(yīng),體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高血糖可通過PKC和ROS激活NF-κB，上調(diào)ICAM-1、MCP-1mRNA及蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。Morcos等研究發(fā)現(xiàn)在DN時(shí)，TEC中含活化的NF-κB和IL-