膿汁和糞便標本中病原菌的檢測

1、張三李四020-62-7891230757-299-85246南方醫(yī)科大學公衛(wèi)學院微生物學系,醫(yī)學微生物學實驗 Medical Microbiology Practicum,微生物學實驗室規(guī)則Lab Safety Regulation,進入實驗室必須穿白大衣，戴帽子。書本、文具放在抽屜里。實驗室內(nèi)不準吃東西、喝飲料，不準把任何東西放入嘴中，也不要用手撫摸頭臉等部位。凡是廢棄的細菌培養(yǎng)物、帶菌材料，應放在指定地點等待滅菌處

2、理，不得隨便亂放或用水沖洗。一旦發(fā)生意外，造成污染，應立即報告老師進行處理。離開實驗室前,必須洗手。懷疑污染應及時用1‰新潔而滅泡手。每次實驗后，實驗臺用消毒液擦拭，地板先用濕的拖布拖地以后再掃地，實驗室用紫外線燈照射1小時。,實驗分組（45人）,倆倆相對4人為一個小組,組號編在電源插座上。每組按從前到后,從左到右的順序，分別編號為甲乙丙丁。,,,,甲 乙 4丙 丁,甲 乙 3

3、丙 丁,甲 乙 2丙 丁,甲 乙 1丙 丁,甲 乙 5丙 丁,甲 乙 8丙 丁,甲 乙 7丙 丁,甲 乙 6丙 丁,甲 乙 10丙 丁,甲 乙 9丙 丁,講 臺,左,右,,

4、,11 甲 乙 丙 丁 戊,實驗分組（40人）,倆倆相對4人為一個小組,組號編在電源插座上。每組按從前到后,從左到右的順序，分別編號為甲、乙、丙、丁。,,,,甲 乙 4丙 丁,甲 乙 3丙 丁,甲 乙 2丙 丁,甲 乙 1丙 丁,甲 乙 5丙 丁,甲 乙 8

5、丙 丁,甲 乙 7丙 丁,甲 乙 6丙 丁,甲 乙 10丙 丁,甲 乙 9丙 丁,講 臺,左,右,實驗分組（36人）,倆倆相對4人為一個小組,組號編在電源插座上。每組按從前到后,從左到右的順序，分別編號為甲、乙、丙、丁。,,,,甲 乙 4丙 丁,甲 乙

6、 3丙 丁,甲 乙 2丙 丁,甲 乙 1丙 丁,5,甲 乙 8丙 丁,甲 乙 7丙 丁,甲 乙 6丙 丁,甲 乙 10丙 丁,甲 乙 9丙 丁,講 臺,左,右,實驗分組（32人）,倆倆相對4人為一個

7、小組,組號編在電源插座上。每組按從前到后,從左到右的順序，分別編號為甲、乙、丙、丁。,,,,甲 乙 4丙 丁,甲 乙 3丙 丁,甲 乙 2丙 丁,甲 乙 1丙 丁,5,甲 乙 8丙 丁,甲 乙 7丙 丁,甲 乙 6丙

8、 丁,10,甲 乙 9丙 丁,講 臺,左,右,實驗室器材介紹,常用器材擺放順序：電源插座→試管架→酒精燈→污物盤。試管架上器材：靠近插座一側(cè)第1列放置接種針,第2列放置接種環(huán)，另一側(cè)中間兩行放置油性筆和打火機。,※器材使用后，必須放回原處，依次擺整齊。,普通冰箱(3顆星***)冷藏室(上柜）：溫度4～8℃，保存細菌培養(yǎng)物，培養(yǎng)基，常用菌種和抗菌素紙片等。冷凍室（下柜）：溫度－18℃，

9、保存診斷血清、血漿，長期保藏的抗菌素紙片。,衛(wèi)生工具：掃帚,拖布,撮箕,垃圾筐,放在冰箱和水池之間。,隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：35～37℃，一般細菌培養(yǎng)時間為18～24小時。,奧林巴斯 CX21型 生物顯微鏡（實驗柜內(nèi)，每人一臺）,注意：只能橫放，不得豎放。,革蘭染色瓶,染色架,石蠟油,拭鏡紙,吸水紙,乙醇乙醚,微生物學器材柜-1（西側(cè)邊臺中段）,電爐→右側(cè)柜內(nèi),微生物學器材柜-2（東側(cè)邊臺中段）,酒精棉球,碘酒棉球,鑷子,電爐、石

10、棉網(wǎng),手套,1500W電爐▲安全警告1.電源插塞與電爐插孔接觸良好→插頭插入插座。2.如果培養(yǎng)基暴沸溢出，流入電爐；必須立即切斷電源、拔除插頭；以免觸電，危及生命！,東西兩側(cè)邊臺各一個電爐，每個電爐可同時放置4個300ml錐形瓶進行加熱。,蒸餾水：配制培養(yǎng)基。1‰新潔而滅：懷疑病原菌污染，泡手3～5分鐘。消毒液：擦拭實驗臺臺面。玻片缸：浸泡用過的載玻片。,醫(yī)學微生物學實驗綜合性實驗一Comprehensive Exper

11、iment 1,膿汁和糞便標本中病原菌的檢測（P2） Isolation and detection of pathogenic bacteria in pus and stool specimens 培養(yǎng)基的制備P2消毒與滅菌P5細菌的人工培養(yǎng)無菌技術（錄像）擺斜面，傾注平板。,,,,,膿汁、痰、咽部分泌物,觀察菌落特征、溶血性、色素,肉湯增菌培養(yǎng),挑取可疑菌落,涂片染色鏡檢,血平板培養(yǎng),直接涂片、革蘭染色、鏡檢,血液、

12、穿刺液,純培養(yǎng),培養(yǎng)液涂片染色境檢,,,染色鏡檢生化反應血清學鑒定,雙糖鐵培養(yǎng)基,增菌培養(yǎng),血、骨髓,挑取可疑菌落,SS瓊脂、伊紅美藍平板分離培養(yǎng),糞便,常見腸道致病菌的檢查程序P48：,常見病原性球菌的檢查程序P47：,,,,,生化反應動物實驗藥敏實驗,,,,膿汁和糞便標本中病原菌的檢測實驗流程(6次課12學時）,①培養(yǎng)基的制備,②細菌的分離培養(yǎng),③細菌的純培養(yǎng),④細菌的形態(tài)學檢查,⑤細菌的生化試驗等,⑥細菌的血清學試驗、結

13、果分析→實驗論文撰寫,,,,,,培養(yǎng)基的制備 Preparation of Culture Media,,※公共培基，勿作標記！,培養(yǎng)基的制備 Preparation of Culture Media,,※公共培基，勿作標記！,培養(yǎng)基的制備 Preparation of Culture Media,,※公共培基，勿作標記！,培養(yǎng)基的制備 Preparation of Culture Media,※公共培基，勿作標記！,,培養(yǎng)基隔

14、石棉網(wǎng)煮沸，使完全溶解。營養(yǎng)肉湯煮沸1次，含瓊脂的培養(yǎng)基煮沸3次(煮至剛剛冒泡,立即放置臺面，半分鐘后再煮)。,加熱時,常搖動。沸騰時，不能搖動！,用洗耳球和刻度吸管分裝培養(yǎng)基。棉塞1/2塞入試管口內(nèi)，松緊合適。,培養(yǎng)基趁熱分裝,培養(yǎng)基裝筐待滅菌,,放置試管筐內(nèi)，罩上硫酸紙牛皮紙，用橡皮筋扎好。,各組邊臺柜子內(nèi)器材,量筒,錐形瓶,砝碼,干粉培養(yǎng)基,試管筐,天平,各組邊臺抽屜內(nèi)器材,試管,刻度吸管,洗耳球,稱量皿2個,藥勺,厘米尺,硫

15、酸紙、牛皮紙、橡皮筋,稱量皿置于左、右盤，游碼移至標尺左端“0”點位置上，指針應對準中線，取得平衡。否則將杠桿兩端的調(diào)整螺母旋動調(diào)節(jié)平衡。,秤物時“左物右碼”，砝碼置右盤，物品置左盤，盡可能放在秤盤中心。天平保持干燥、清潔。用過的藥勺、稱量皿清洗干凈。,稱量皿置于左盤，游碼移至標尺左端“0”點位置上，指針應對準中線，取得平衡。否則將杠桿兩端的調(diào)整螺母旋動調(diào)節(jié)平衡。,秤物時“左物右碼”，砝碼置右盤，物品置左盤，盡可能放在秤盤中心。天平保持

16、干燥、清潔。用過的藥勺、稱量皿清洗干凈。,培養(yǎng)基配制器材,內(nèi)蓋蓋好外蓋扭緊,培養(yǎng)基制備程序,干粉培養(yǎng)基→蒸餾水→加熱溶化→分裝→集中放在試管筐里→ 罩上硫酸紙、牛皮紙→ 用橡皮筋扎好 →放入講臺邊的滅菌桶或滅菌筐內(nèi)→送到高壓蒸汽滅菌室（洗刷室）→滅菌。 ※請在 30分鐘內(nèi)完成。,培養(yǎng)基的制備 Preparation of Culture Media,,※公共培基，勿作標記！,,,Preparation of Culture me

17、dia,Group formation: Four students each form one group Total of 10 groups (10× 4= 40) Each group will prepare the media according to the instruction given in next slide.,Preparation of Culture Media,,Melt agar

18、 into solution in the microwave or electric stove,玻璃器材的洗刷,無污染器皿:洗滌劑洗刷→流水沖洗10次→晾干。病原菌污染的器材→高壓蒸汽滅菌→趁熱倒出污物→洗滌劑浸泡→瓶子、試管、吸管用毛刷，平皿用紗布，洗刷干凈→流水沖洗10次→晾干。,瓶刷,試管刷,吸管刷,去污粉,紗布,收拾器材，放回邊臺柜內(nèi)，依次擺整齊!,量筒,錐形瓶,砝碼,干粉培養(yǎng)基,試管筐,天平,量筒→罩紙?zhí)?，扎皮?。錐

19、形瓶→洗干凈，塞棉塞，罩紙?zhí)祝そ?。干粉培養(yǎng)基→內(nèi)外蓋子，必須蓋好扭緊！,收拾器材，放回抽屜內(nèi)，依次擺整齊!,試管,刻度吸管,洗耳球,稱量皿,藥勺,厘米尺,硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋,藥勺、稱量皿、刻度吸管洗刷干凈，甩去水滴，放回邊臺抽屜內(nèi)。,,,細菌培養(yǎng)基 Culture Media,用人工的方法，將多種營養(yǎng)物質(zhì)，根據(jù)各種微生物生長繁殖的需要而合成的一種營養(yǎng)制品。它的主要成分是蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉和水，pH7.4～7.6。培養(yǎng)基

20、制備的一般程序： ①調(diào)配→溶化→ 矯正pH →分裝→滅菌→檢定→保存。 ②干粉培養(yǎng)基→蒸餾水→加熱溶化→分裝→滅菌→檢定 →保存。培養(yǎng)基的制備原則： (1)適當?shù)臓I養(yǎng)成分,(2)合適的酸堿度,(3)配制后必須滅菌。,培養(yǎng)基的種類（按物理性狀分類）液體培養(yǎng)基:不含凝固劑(瓊脂),用于增菌，純培養(yǎng),保種。固體培養(yǎng)基:含1％～2％瓊脂，用于分離培養(yǎng),純培養(yǎng),保種。半固體培基（瓊脂高層）:含0.3％～0.5％瓊

21、脂，用于動力檢測,保種。,營養(yǎng)肉湯 broth tube 瓊脂斜面 agar slant 瓊脂高層 agar deep,Different forms of culture media.,培養(yǎng)基的種類（按用途分類）P3基礎培養(yǎng)基:含一般細菌生長繁殖所需的基本營養(yǎng)成分，可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎成分，如普通平板。營養(yǎng)培養(yǎng)基：在基礎培養(yǎng)基中加入血液、生長因子等特殊成分，供營養(yǎng)要求較高的細菌和須要特殊生長因子的細菌生

22、長，如血平板。增菌培養(yǎng)基：促進目的菌的生長，適用于含菌量較少的標本，如葡萄糖肉湯。選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入抑制劑抑制雜菌生長，有助于目的菌的生長，如EMB、SS平板。鑒別培養(yǎng)基：利用細菌分解能力及代謝產(chǎn)物的不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，用來試驗細菌的生化反應、代謝產(chǎn)物，如糖發(fā)酵管。厭氧培養(yǎng)基：氧化還原電勢低，表面用凡士林和石蠟封住，與空氣隔絕，成為無氧環(huán)境，如庖肉培養(yǎng)基。,培養(yǎng)基的滅菌,在冷空氣完全排盡的情況下，

23、蒸汽壓103.43 kPa ,溫度可達到121.3℃ ,維持15～30分鐘，可以殺滅包括細菌芽胞在內(nèi)的所有微生物。基礎培養(yǎng)基：121℃高壓蒸汽滅菌15～30分鐘。含糖培養(yǎng)基：115℃滅菌15分鐘。雞蛋、牛奶培養(yǎng)基:75～100℃30分鐘，3次(1天1次)。不耐高溫的液體成分：濾菌器濾過除菌EK型蔡氏濾器、 G5或G6玻璃濾器、0.45um或0.22um微孔濾膜。,瓊脂平板 agar plate,含瓊脂的培養(yǎng)基滅菌以后，冷卻50

24、～60℃（溫度越高，冷凝水越多，越易污染 ），以無菌操作，傾注平皿10ml（直徑7厘米平皿），瓊脂凝固后形成瓊脂平板。 平板主要用于細菌的分離培養(yǎng)和藥敏試驗。,平板儲存待用或做細菌培養(yǎng)時，為什么要倒置？①防止平板水分蒸發(fā)丟失。②防止冷凝水滴于平板表面，影響單菌落形成。③……,瓊脂斜面 agar slant,含瓊脂的培養(yǎng)基滅菌以后，趁熱斜放，培基不超過試管長度的2/3，瓊脂凝固以后形成一個傾斜的表面。 斜面主要用于純菌

25、移種和菌種保存。 斜面底部的冷凝水有利于純菌移種、菌苔形成和菌種保藏。,怎樣檢查培養(yǎng)基是否合格?,★無菌試驗：將待檢培養(yǎng)基置于35～37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，無任何細菌生長為合格?！镄Ч囼灒簩⒁阎臉藴蕝⒖季?，接種于待檢培養(yǎng)基中，檢查細菌的生長繁殖狀況和生化反應是否與預期的結果相符合。,細菌生長繁殖的方式和速度,細菌繁殖方式：以二分裂方式進行無性繁殖。繁殖速度：多數(shù)20～30分鐘繁殖1代，結核桿菌18～2

26、0小時繁殖一代。細菌生長繁殖曲線,細菌的生長曲線,細菌數(shù)量的對數(shù),培養(yǎng)時間（小時）,5 10 15 20 25 30,,,活菌數(shù),總菌數(shù),遲緩期,對數(shù)生長期,穩(wěn)定期,衰退期,細菌生長曲線意義,遲緩期：一般1～4h，細菌代謝活躍，但不繁殖。對數(shù)期：維持4～8h，細菌快速繁殖，數(shù)目呈幾何級數(shù)增加，細菌形態(tài)、染色性、生理活性最典型、對抗菌素最敏感。細菌鑒定選

27、用此期為佳。穩(wěn)定期： 通常維持10h，活菌數(shù)和死菌數(shù)幾乎相等，代謝產(chǎn)物形成較多。衰亡期：培養(yǎng)18 ～24 h以后，代謝逐漸停滯,死菌數(shù)超過活菌數(shù)。,玻璃器材的洗刷,無污染器皿:洗滌劑洗刷→流水沖洗10次→晾干。病原菌污染的器材→高壓蒸汽滅菌→趁熱倒出污物→洗滌劑浸泡→瓶子、試管、吸管用毛刷，平皿用紗布，洗刷干凈→流水沖洗10次→晾干。,瓶刷,試管刷,吸管刷,去污粉,紗布,①試管用毛刷，上下、旋轉(zhuǎn)刷洗內(nèi)壁和管底。,②字跡用濕紗布，粘

28、去污粉擦拭。,③管口朝向相同，流水沖洗10次。,④洗干凈的試管，倒扣在筐內(nèi)，晾干。,平皿用紗布，旋轉(zhuǎn)擦拭內(nèi)外側(cè)，字跡用紗布粘去污粉擦拭。,流水沖洗10次。逐個倒扣在筐內(nèi)，晾干。,玻璃器材洗干凈的標準,1.洗滌時觀察:洗后的玻璃器材附著在內(nèi)壁上的水不是個別水珠,而是一層極薄的水膜。2.干燥后觀察:對著光亮處觀看玻璃器材,非常透明, 內(nèi)外壁上不出現(xiàn)大片發(fā)白或白點,也無微小污點和粉末。,收拾器材，放回邊臺柜內(nèi)，依次擺整齊!,量筒,錐形瓶,

29、砝碼,干粉培養(yǎng)基,試管筐,天平,量筒→罩紙?zhí)?，扎皮?。錐形瓶→洗干凈，塞棉塞，罩紙?zhí)?，扎皮?。干粉培養(yǎng)基→內(nèi)外蓋子，必須蓋好扭緊！,收拾器材，放回抽屜內(nèi)，依次擺整齊!,試管,刻度吸管,洗耳球,稱量皿,藥勺,厘米尺,硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋,藥勺、稱量皿、刻度吸管洗刷干凈，甩去水滴，放回邊臺抽屜內(nèi)。,常用器材擺放順序：電源插座→試管架→酒精燈→污物盤。試管架上器材：靠近插座一側(cè)第1和第2列分別放置接種針和接種環(huán)，另一側(cè)中間兩行

30、放置油性筆和打火機。,※器材使用后，必須放回原處，依次擺整齊。,實驗器材 整齊有序,醫(yī)學微生物學實驗綜合性實驗一,膿汁和糞便標本中病原菌的檢測（一）培養(yǎng)基的制備P2消毒與滅菌P5細菌的人工培養(yǎng)無菌技術（錄像）擺斜面，傾注平板。,思考題,人工培養(yǎng)細菌需要提供的條件是什么? 培養(yǎng)基制備的原則是什么?怎樣檢查培養(yǎng)基是否合格? 培養(yǎng)基按物理形狀分哪幾種?各有何用途?高壓蒸汽滅菌法的殺菌機理是什么?,固體培養(yǎng)基的制備（課外