特種蛋白的免疫測(cè)定及臨床意義

1、特定蛋白的免疫測(cè)定及臨床意義,衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心 李金明,特定蛋白的免疫測(cè)定方法,基本原理：免疫沉淀反應(yīng) 免疫透射比濁 免疫散射比濁,免疫沉淀反應(yīng)的發(fā)展歷史,1897年，Kraus發(fā)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)液與其相應(yīng)抗血清混合后出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀反應(yīng) 1902年Ascoli建立了環(huán)狀沉淀試驗(yàn)。1905年Bechhold將抗體混溶在明膠中，然后再將相應(yīng)特異抗原加于其上，抗原抗體的特異結(jié)合可在明膠中出現(xiàn)沉淀。1946年Oudi

2、n報(bào)道了試管單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)。（ 1965年Mancini又提出了平板單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)。） Grabar和Williams在1953年報(bào)道了免疫電泳。（對(duì)流免疫電泳、火箭免疫電泳和免疫固定電泳）上述為經(jīng)典免疫沉淀試驗(yàn)發(fā)展階段，測(cè)定范圍窄（10 ~ 100 μg/ml）、靈敏度低，繁瑣費(fèi)時(shí)，不能自動(dòng)化。,免疫沉淀反應(yīng)的發(fā)展歷史,1959年，Schultze等報(bào)道了透射比濁法（Transmission turbidimetry)。19

3、67年，Ritchie等報(bào)道了散射比濁法(nephelometry)。1977年，Sternberg等進(jìn)一步發(fā)展建立了速率散射比濁法(Rate nephelometry)。免疫比濁測(cè)定方法與免疫沉淀方法相比，靈敏度高，重復(fù)性好，測(cè)定范圍寬，已用于臨床體液特定蛋白含量的測(cè)定，現(xiàn)已有多種自動(dòng)化檢測(cè)儀器應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，尤其是免疫散射比濁測(cè)定。,免疫透射比濁,基本原理：一定波長(zhǎng)光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)混合液時(shí)，被其中的免疫復(fù)合物（IC）反射或遮

4、擋、吸收而減弱。在一定范圍內(nèi)，透射光被吸收的量與免疫復(fù)合物的量呈正比，后者又與相應(yīng)抗原和抗體的量呈函數(shù)關(guān)系。抗體量一定，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲知抗原的量。由于要求抗原抗體復(fù)合物的數(shù)量足夠，并且顆粒要足夠大（35~100nm），本法的測(cè)定靈敏度和準(zhǔn)確度相對(duì)較低。,免疫散射比濁,基本原理：光線通過(guò)檢測(cè)溶液時(shí)，被其中所含的抗原抗體復(fù)合物折射而部分偏轉(zhuǎn)，產(chǎn)生散射光。根據(jù)雷利散射公式，在一定條件下，透射光與微粒濃度成正比，散射光與微粒濃度成反比。散

5、射比濁可分為終點(diǎn)和速率散射比濁兩種。光源 熒光：高壓汞燈發(fā)射，入射光波長(zhǎng)（?）355nm，散射夾角（?）為90℃ 激光：氦氖燈，?=663nm，?=15~35℃ 碘鎢光：碘鎢燈，?=400~500nm，?=70℃,影響免疫比濁測(cè)定的主要因素,抗原、抗體比例與濁度關(guān)系：抗原過(guò)量，出現(xiàn)“帶現(xiàn)象”，IC分子小，且可發(fā)生再解離，濁度下降，光散射減少?？贵w過(guò)量，IC形成隨抗原量增加到抗原抗體最適比例時(shí)達(dá)高峰?？贵w須過(guò)量但

6、又必須適量，抗體濃度是測(cè)定關(guān)鍵。,影響免疫比濁測(cè)定的主要因素,抗體質(zhì)量：特異性、效價(jià)、親和力、R型抗體 高親和性抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原表位的空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不容易解離。反之，低親和性抗體與抗原形成的復(fù)合物較易解離。 R型抗體以家兔免疫血清為代表，具有較寬的抗原抗體合適比例范圍，只在抗原過(guò)量時(shí)，才易出現(xiàn)溶性免疫復(fù)合物，大多數(shù)動(dòng)物的免疫血均屬此型。H型抗體以馬免疫血清為代表，其抗原與抗體的合適比例范

7、圍較窄，抗原或抗體過(guò)量，均可形成可溶性免疫復(fù)合物。人和許多大動(dòng)物的抗血清皆屬H型。,影響免疫比濁測(cè)定的主要因素,反應(yīng)溶液：pH6.5~8.5，適當(dāng)濃度電解質(zhì)（中和抗原抗體復(fù)合物表面電荷，促進(jìn)凝聚）、離子強(qiáng)度（大，IC形成快）；一般常用磷酸鹽緩沖液。增濁劑：非離子型親水劑如聚乙二醇（PEG）、吐溫-20等，以PEG6000最好，濃度一般為3%~4%。濃度過(guò)高可致非特異沉淀。,特定蛋白測(cè)定的質(zhì)量控制,室內(nèi)質(zhì)量控制室間質(zhì)量評(píng)價(jià),特定蛋白

8、測(cè)定的臨床意義,血液中含有多種功能蛋白，如載體蛋白、免疫球蛋白（抗體）、酶、凝血因子等，其含量變化通常與多種疾病有密切關(guān)系。C反應(yīng)蛋白 (CRP) 、免疫球蛋白及亞類(lèi)、補(bǔ)體C3和C4、抗鏈球溶血素O (ASO) 、類(lèi)風(fēng)濕因子 (RF)、前白蛋白 (Prealbumin) 、白蛋白 (Albumin) 、微白蛋白 (Microalbumin) β2微球蛋白(β2Microglobulin) 、 α1抗胰蛋白酶 (α1AT) 、銅藍(lán)蛋白

9、 (Caeruloplasmin) 、結(jié)合珠蛋白 (Haptoglobin) 、轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Transferrin) 、載脂蛋白A （APO-A1） 、載脂蛋白B （APO-B）等。,C反應(yīng)蛋白 (CRP),是一種由肝細(xì)胞合成的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，是在炎癥和組織壞死疾病的急性期出現(xiàn)于病人血清中的一種糖蛋白，它能與肺炎雙球菌的莢膜成分C-多糖蛋白質(zhì)起反應(yīng)，故稱為C-反應(yīng)蛋白。具有激活補(bǔ)體和促進(jìn)粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞吞噬作用。正常值為：800

10、-8000μg/L。CRP是急性時(shí)相反應(yīng)的一個(gè)極為靈敏的指標(biāo)，血漿中CRP濃度在急性心肌梗死、創(chuàng)傷、感染、炎癥、外科手術(shù)、腫癌浸潤(rùn)時(shí)迅速顯著地增高，可達(dá)正常水平的2000倍。結(jié)合臨床病史，有助于隨訪病程。特別在炎癥過(guò)程中，CRP可作為風(fēng)濕病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白血病等的隨訪指標(biāo)。細(xì)菌和病毒感染鑒別，細(xì)菌感染急性期一般均增高，病毒感染多數(shù)不變。國(guó)外有研究認(rèn)為，CRP是引發(fā)心臟病的最強(qiáng)烈的危險(xiǎn)因素，其危險(xiǎn)程度是血液中過(guò)量膽固醇的2倍。

11、CRP含量高的人患高血壓的危險(xiǎn)率比膽固醇高的人大1倍。如果炎癥和過(guò)高的膽固醇同時(shí)出現(xiàn)的話，那么患心臟病和中風(fēng)的危險(xiǎn)率比正常的人要高出9倍。由此可見(jiàn)，CRP含量高和患心臟病呈正相關(guān)。此外，最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，血中高濃度的CRP是結(jié)腸癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素，并認(rèn)為CRP可能是結(jié)腸癌的一個(gè)早期標(biāo)志物。,免疫球蛋白及亞類(lèi),其濃度在不同年齡段有所差異，在某些疾病情況下，這些指標(biāo)的濃度將出現(xiàn)升高或降低，從而具有疾病診斷價(jià)值。IgG：正常情況下，臍血7.

12、6～17g／L， 新生兒7.0～14.8g／L， 0.5～6月3～10.0g／L ，6月～2歲5～12g／L ，2～6歲5～13g／L， 6～12歲7～16.5g／L ，12～16歲7～15.5g／L ，成人6～16g／L。在慢性肝病，亞急性或慢性感染，結(jié)締組織疾病，ＩｇＧ骨髓瘤，無(wú)癥狀性單克?。桑纾遣〉?，出現(xiàn)增高；在遺傳性或獲得性抗體缺乏癥，混合性免疫缺陷綜合癥，選擇性ＩｇＧ缺乏癥，蛋白丟失性腸病，腎病綜合癥，強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良，免疫

13、抑制劑治療等降低。,免疫球蛋白及亞類(lèi),IgA：正常情況下，臍血0～50mg／L，新生兒0～22mg／L，0.5～6月3～820mg／L，7月～2歲140～1080mg／L，2～6歲230～1900mg／L，6～12歲290～2700mg／L，12～16歲810～2320mg／L，成人760～3900mg／L。在慢性肝病，亞急性或慢性感染性疾?。ㄈ缃Y(jié)核、真菌感染等），自身免疫性疾?。ㄈ纾樱蹋?、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎），囊性纖維化，家族性嗜中性粒

14、細(xì)胞減少癥，乳腺癌，ＩｇＡ腎病，ＩｇＡ骨髓瘤等情況下增高；在遺傳性或獲得性抗體缺乏癥，免疫缺陷病，選擇性ＩｇＡ缺乏癥，無(wú)γ－球蛋白血癥，蛋白丟失性腸病，燒傷等?？梗桑纾量贵w現(xiàn)象，免疫抑制劑治療，妊娠后期等情況下降低。,免疫球蛋白及亞類(lèi),IgM：正常情況下，臍血40～240mg／L，新生兒50～300mg／L，0.5～6月150～1090mg／L，6月～2歲430～2390mg／L，2～6歲500～1990mg／L，6～12歲500～26

15、00mg／L，12～16歲450～2400mg／L，成人400～3450mg／L。在胎兒宮內(nèi)感染，新生兒ＴＯＲＣＨ癥群，慢性或亞急性感染，瘧疾，傳染性單核細(xì)胞增多癥，支原體肺炎，肝病，結(jié)締組織疾病，巨球蛋白血癥，無(wú)癥狀性單克?。桑纾筒〉惹闆r下增高。在遺傳性或獲得性抗體缺乏癥，混合性免疫缺陷綜合癥，選擇性ＩｇＭ缺乏癥，蛋白丟失性腸病，燒傷，抗Ｉｇ抗體綜合癥（混合性冷球蛋白血癥），免疫抑制劑治療等情況下降低。,IgG和IgA亞類(lèi),IgG有

16、四種不同的亞類(lèi)，IgA有兩種不同的亞類(lèi)。每種亞類(lèi)具有不同的功能，其含量過(guò)低或過(guò)高或者缺陷會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的免疫功能低下，造成相應(yīng)的疾病的發(fā)生。兒童常見(jiàn)的反復(fù)呼吸道感染、經(jīng)常腹瀉、發(fā)育遲緩等癥狀以及經(jīng)常發(fā)生的許多呼吸道疾病如中耳炎、鼻竇炎、肺炎、氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張以及哮喘等疾病，往往都與IgG或IgA亞類(lèi)缺陷有關(guān)。,補(bǔ)體C3和C4,正常情況下，C3(β1C-球蛋白) 800～1550mg／L，C4(β1E-球蛋白) 130～

17、370mg／L，血液補(bǔ)體含量與活度在許多病理情況下都會(huì)發(fā)生變化。所以，臨床上應(yīng)動(dòng)態(tài)觀察補(bǔ)體水平的變化。補(bǔ)體含量下降并不一定代表免疫功能障礙或免疫缺陷，因?yàn)樵谌毖?、凝固性壞死和中毒性壞死時(shí)，組織能釋放較多的蛋白分解酶，導(dǎo)致補(bǔ)體溶血活度和補(bǔ)體組分的下降。 血補(bǔ)體濃度升高：見(jiàn)于各種炎癥性疾病及阻塞性黃疸，急性心肌梗塞，潰瘍性結(jié)腸炎，糖尿病，急性痛風(fēng)，急性和急性甲狀腺炎，急性風(fēng)濕熱，皮肌炎，多發(fā)性肌炎，混合性結(jié)締組織病，結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周?chē)椎取?/p>

18、,抗鏈球溶血素O (ASO),A群溶血性鏈球菌的代謝產(chǎn)物刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體。ASO升高見(jiàn)于A群溶血性鏈球菌感染及感染后免疫反應(yīng)所致的疾病，如：感染性心內(nèi)膜炎、扁桃體炎、風(fēng)濕熱、鏈球菌感染后急性腎小球腎炎。ASO在溶血性鏈球菌感染后一周開(kāi)始升高，4～6周達(dá)高峰，并持續(xù)數(shù)月，故ASO增高提示曾有溶血性鏈球菌感染，但不一定是近期感染。鏈球菌感染后ASO動(dòng)態(tài)升高，結(jié)合CRP升高及血沉陽(yáng)性，有利于風(fēng)濕熱的診斷。高膽固醇血癥、巨球蛋白血癥、多發(fā)

19、行骨髓瘤患者，ASO也可升高。,類(lèi)風(fēng)濕因子 (RF),RF是一種以變性IgG為靶抗原的自身抗體，RF可分為IgM、IgG、IgA、IgE四型。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者的陽(yáng)性率為70％～80％，其中尤其以病變廣泛、病情嚴(yán)重、病程長(zhǎng)、活動(dòng)期及有關(guān)節(jié)外病變者的陽(yáng)性率高、滴度高并長(zhǎng)久存在。除類(lèi)風(fēng)濕外，ＲＦ還見(jiàn)于正常人和其他疾病，例如正常人，尤其老年人，陽(yáng)性率占５％－１０％；各種感染性疾病如乙肝、結(jié)核病、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎和慢性支氣管炎等；

20、結(jié)締組織病如紅斑狼瘡、干燥綜合征、皮肌炎、血管炎、硬皮病、預(yù)防接種后以及某些惡性疾病。在這些疾病中，ＲＦ的陽(yáng)性率可達(dá)１０％－７０％。因此，在RA的診斷上，一般認(rèn)為RF只有參考價(jià)值而無(wú)特異性診斷價(jià)值。,前白蛋白 (Prealbumin),為肝內(nèi)合成的糖蛋白，血中半壽期極短，故可作為營(yíng)養(yǎng)不良的診斷、檢測(cè)及肝病的診斷。作為早期肝功能操作指示，比ALT特異，比白蛋白敏感。正常參考值范圍：成年男女為250-----400mg/L ；兒童 12

21、5-----200mg/LPA是負(fù)性急性時(shí)相蛋白。在炎癥和惡病質(zhì)（如惡性腫瘤等）中，CRP和酸性糖蛋白升高時(shí)，PA則可見(jiàn)迅速降低。如果前白蛋白繼續(xù)保持低水平或進(jìn)一步降低，提示預(yù)后不良。 在腸道或腎臟的耗蛋白性病變時(shí)，血清PA濃度也會(huì)相隨降低。 何杰金氏及青春發(fā)育期少年，其血清PA 濃度升高較顯著。,白蛋白 (Albumin),正常值：35-55g/L高：脫水和血液濃縮。降低：白蛋白合成障礙：營(yíng)養(yǎng)不良、肝臟疾病、慢性消化道疾病。白

22、蛋白消耗或丟失過(guò)多：消耗性疾病、惡病質(zhì)、腎病綜合征、急性大出血、嚴(yán)重?zé)齻?、腹水形成等。其他：妊娠晚期、遺傳性無(wú)白蛋白血癥。,β2微球蛋白(β2Microglobulin),β2－微球蛋白是體內(nèi)有核細(xì)胞產(chǎn)生的一種小分子球蛋白。正常人血液中β2－微球蛋白濃度很低。血液中升高：腎小球?yàn)V過(guò)功能下降。炎癥或腫瘤。尿液中升高：腎小管受損時(shí)，對(duì)β2－微球蛋白β2－微球蛋白的重吸收減少，尿液中β2－微球蛋白排出增加，測(cè)定時(shí)升高。,α1抗胰蛋白酶 (

23、α1AT),α1-抗胰蛋白酶是一種特異性抑制絲氨酸蛋白水解酶的蛋白酶抑制物。血液中正常值：2~3g/L。缺陷通常有遺傳原因。濃度低于正常水平的30-40%時(shí)，肝臟和肺部疾病相關(guān)的臨床表現(xiàn)（肝硬化、支氣管擴(kuò)張、胰腺纖維化）才會(huì)明顯出現(xiàn)。兒童通常受到肝臟疾病影響，而成人更多的為肺部疾病。DIC、甲亢和十二指腸潰瘍等，血中α1AT可減少。升高大多數(shù)是由于感染或炎癥的急性期反應(yīng)引起。這種情況下，α1-抗胰蛋白酶濃度較正常情況3倍升高。在妊娠

24、和口服避孕藥后，α1-抗胰蛋白酶也可升高。,銅藍(lán)蛋白 (Caeruloplasmin，CER),屬?2糖蛋白，是鐵氧化還原酶，又稱鐵氧化酶，由肝臟合成，含6~8銅原子而呈藍(lán)色，故名銅藍(lán)蛋白。升高者有妊娠、服雌性激素和甲狀腺素者、壞死、傳染（新近感染的一種指標(biāo)）。惡性腫瘤、矽肺等。CER是塵肺最靈敏的早期診斷指標(biāo)，早于肺部X線片的改變。降低者有腎病綜合癥，低蛋白血癥（營(yíng)養(yǎng)不良，胃腸道患者）、急性肝炎、嚴(yán)重肝損傷、多發(fā)性硬化等。Wils

25、on氏?。ǜ胃]狀核變性，是一種遺傳性病變）CRE明顯減少。,轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Transferrin，Tf),Tf是一種能結(jié)合三價(jià)鐵的糖蛋白。是血漿中主要的含鐵蛋白質(zhì)，代表了機(jī)體鐵的貯量。它負(fù)責(zé)運(yùn)輸由消化道吸收的鐵和由紅細(xì)胞降介釋放的鐵。正常值：成人為2.20-4.0g/L；新生兒為1.30-2.75g/L降低可見(jiàn)于如下疾患:急性肝炎(開(kāi)始↗;后↘；)肝病(重癥肝炎>肝硬化>慢性肝>慢遷肝>急肝),腎病綜合癥、蛋白

26、丟失癥、甲狀腺疾患。增高可見(jiàn)于:妊娠、缺鐵性貧血、急肝早期。,結(jié)合珠蛋白 (Haptoglobin),結(jié)合珠蛋白又稱觸珠蛋白，主要由肝臟合成。降低：血管內(nèi)溶血時(shí)，結(jié)合珠蛋白與紅細(xì)胞溶解釋放出來(lái)的血紅蛋白相結(jié)合，結(jié)合珠蛋白/血紅蛋白復(fù)合體很快就會(huì)從血中清除，從而導(dǎo)致結(jié)合珠蛋白濃度下降，嚴(yán)重溶血甚至可消耗光結(jié)合珠蛋白，各種溶血時(shí)血清結(jié)合珠蛋白均有降低，以血管內(nèi)溶血時(shí)減低最顯著，甚至測(cè)不出來(lái)。兒童結(jié)合珠蛋白血清生理濃度較低，故不適合用紅

27、細(xì)胞溶血檢測(cè)。結(jié)合珠蛋白是一種急性期反應(yīng)蛋白，在炎癥時(shí)可達(dá)到很高的濃度。感染、創(chuàng)傷、惡性腫瘤、紅斑狼瘡、皮質(zhì)激素治療等結(jié)合珠蛋白可升高。,載脂蛋白A-I和B-I （APO-A，B）,載脂蛋白A-I和B-I主要由肝臟和小腸合成。APO-A-I降低：冠心病、腦血管病等。APO-B是動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志物之一，升高提示動(dòng)脈粥樣硬化。APO-A-I/ APO-B100<1可視為心血管病疾病的危險(xiǎn)指標(biāo)，其比值與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化狹窄程