臨床細菌室厭氧菌培養(yǎng)基本程序張秀珍

1、臨床細菌室厭氧菌培養(yǎng)基本程序,張秀珍,內(nèi)容,厭氧培養(yǎng)基本設備厭氧標本采集和運送步驟厭氧菌的分離和鑒定步驟厭氧菌的報告厭氧菌的藥敏試驗厭氧菌的菌種保存,厭氧培養(yǎng)基本設備,厭氧菌培養(yǎng)的基本條件及設備,設備 北京醫(yī)院細菌室采用方式 生產(chǎn)廠商床邊采樣設備 厭氧袋試驗合，內(nèi)含氣體發(fā)生器 及指示劑共20套(45534) 法國生物梅里埃輸送

2、培養(yǎng)基 Amies輸送瓊脂(41998、41999) 難辯梭菌瓊脂(43213) 法國生物梅里埃常規(guī)準備培養(yǎng)基 厭氧血瓊脂或 斯氏瓊脂+5%羊血(43273) 斯氏萬古霉素+5%羊血(43223) 自制或法國生物梅里埃厭氧氣袋 厭氧氣體發(fā)生器 10個/盒(96121) 法國生物梅

3、里埃厭氧盒或厭氧罐 5～10個厭氧盒(96127)： 法國生物梅里埃厭氧罐： 英國OXOID公司 法國生物梅里埃,厭氧培養(yǎng)的培養(yǎng)基,初代接種厭氧菌最好使用新配制的培養(yǎng)基。 平板培養(yǎng)基無需在厭氧條件下貯存，用前可進行預還原，但厭氧條件下貯存可延長培養(yǎng)基的有效期。實驗室常規(guī)準備厭氧培養(yǎng)分離的培養(yǎng)基是厭氧血瓊脂.,必備厭氧培養(yǎng)用培養(yǎng)基,斯氏瓊脂+5%羊血

4、：適用所有厭氧菌生長斯氏萬古霉素+5%羊血：適用革蘭陰性厭氧菌的分離難辯梭菌選擇培養(yǎng)基(CCFA)：分離難辯梭菌改良厭氧血平皿,改良厭氧血平皿配制,成分：血瓊脂基礎按配方 半胱氨酸： 0.4克 氯化血紅素(5mg/ml): 1ml 1%維生素K1: 0.1ml配制方法:上述各成分混合，加熱溶解冷卻后調整pH7.4。高壓滅菌后冷卻至50℃時加入5-10%的脫釬維

5、羊血，混合后傾注平皿。用途：營養(yǎng)好可供大多數(shù)厭氧菌生長質量控制：產(chǎn)黑色素普雷沃菌形成典型菌落和色素；產(chǎn)氣夾膜梭菌有雙圈溶血。,幾種重要的厭氧選擇培養(yǎng)基,卡那霉素、萬古霉素溶血平板 (KVB)：類桿菌屬，特別是脆弱類桿菌和產(chǎn)黑色素擬桿菌、卡那霉素膽鹽七葉苷平皿 (BBE)：脆弱類桿菌環(huán)絲氨酸、先鋒克西叮、果糖、蛋黃平皿(CCFA)：難辯梭菌,提供厭氧環(huán)境方法：,使用厭氧罐+換氣法、厭氧罐+產(chǎn)氣袋法厭氧袋+產(chǎn)氣袋法厭氧手套箱法

6、。配指示劑,厭氧培養(yǎng)裝置,厭氧手套箱：價格昂貴、操作時間長、氣體消耗大、不易推廣厭氧盒+厭氧氣袋：應用最普遍、簡便或厭氧罐+厭氧氣袋：方便實用厭氧罐抽氣換氣法：需配置抽氣換氣裝置第二代厭氧氣體發(fā)生劑不需加水、不需觸酶,厭氧標本的選擇、采集和運送,可疑厭氧菌感染特征,感染局部產(chǎn)生氣體分泌物有惡臭分泌物帶血或呈黑色粘膜周圍的感染，如肛周、口腔、鼻竇、咽頰等細菌培養(yǎng)陰性，但有菌血癥表現(xiàn)長期使用氨基糖苷類抗生素，但無效者

7、有基礎疾病免疫低下者,需做厭氧血培養(yǎng)的高危人群,腸膿毒癥、女性生殖道感染、褥瘡及呼吸道感染患者ICU患者或近期做過腹部外科手術的患者嚴重燒傷和外傷患者伴有嚴重心血管疾病、糖尿病、惡性腫瘤、移植和免疫抑制患者老年患者臨床高度懷疑有厭氧菌感染的患者,絕大多數(shù)住院患者需要做厭氧血培養(yǎng),1.正確地選擇標本,下列細菌學指征有助于選擇標本做厭氧培養(yǎng)：（1）深部傷口或軟組織膿腫的膿，特別是伴有惡臭或含有硫磺顆粒時。（2）可疑為氣性壞疽或

8、少見的嚴重產(chǎn)氣或壞死性感染所取得的壞死組織或病灶清除材料。（3）粘膜部位的感染灶取得的材料。（4）從腦、肺、肝或其他器官的膿腫或從腹腔內(nèi)、肛周、隔下或其他部位的膿腫取得的材料。,,（5）無菌區(qū)感染灶的吸出液(包括血液、腦脊液、腹水、胸水、滑膜液、羊水等)。（6）人或動物咬傷感染灶取得的材料。（7）變黑的或置于紫外線發(fā)紅色熒光的滲出物。（8）革蘭染色，鏡下見到具有厭氧菌獨特形態(tài)的材料。（9）可疑引起肉毒桿菌食物中毒的食物。,2

9、.正確地收集標本,不能做厭氧培養(yǎng)的標本：（1）咽、鼻、尿道或直腸拭子。（2）咳出的痰，通過支氣管鏡取的分泌物，排出或導出的尿、糞及胃內(nèi)容物。,可做厭氧培養(yǎng)的標本,（1）從未開放的膿腫抽取膿液。（2）通過胸腔穿刺抽出的胸腔液。（3）從恥骨聯(lián)合上方做膀胱穿刺吸出或從腎造口管收集的尿。（4）氣管切開吸取的肺分泌物。 （5）女性生殖器：后穹隆穿刺。,,（6）穿刺抽出的腹腔液。（7）通過腰椎穿刺抽出的腦脊液。（8）竇道標本可

10、插入小導管用注射器吸出，注射器和針頭內(nèi)的氣體應全部排出，將其內(nèi)容物直接注入一個已排出氣的無菌試管內(nèi)。也可自竇道損傷部位取材做活組織檢查。,3.床邊采集標本的步驟,1.除去表面陳舊的膿和分泌物,從深處吸出或刮取標本.2.首先接種在厭氧培養(yǎng)基,立即置厭氧盒或厭氧罐內(nèi),同時撕開并放入產(chǎn)氣袋,放指示劑,立即蓋好蓋或封好厭氧袋口.3.剩余部分標本種需氧培養(yǎng)基4.剩余最后標本作涂片兩張5到達實驗室后，將已接種需氧和厭氧的培養(yǎng)皿置35度培養(yǎng),

11、4.血液以外無菌體液接種,膽汁、胸腹水、腦脊液等無菌體液：按比例直接種入?yún)捬跹囵B(yǎng)瓶中抽取標本種入?yún)捬踉鼍囵B(yǎng)基，同時接種厭氧血平皿，全部放厭氧罐，立即放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋并立即蓋好蓋，放35度培養(yǎng)48h。,5.不能立即接種的厭氧標本,1.由主管醫(yī)生采集,必須深部新分泌物2.采集后立即放入輸送培養(yǎng)基3.24h內(nèi)送到實驗室,厭氧標本采集的方法,帶著厭氧產(chǎn)氣袋和厭氧袋或厭氧罐到床邊采集標本無菌體液如胸腹水、膽汁和血均可注入自動

12、血培養(yǎng)系統(tǒng)的厭氧培養(yǎng)瓶。不 能立即接種的標本應采用輸送培養(yǎng)基，可保存厭氧菌24-48h,厭氧標本的分離和鑒定,厭氧菌分離的基本分離步驟,第一次耐氧試驗:初始標本需氧和厭氧對照,發(fā)現(xiàn)可疑菌落(需氧環(huán)境不生長菌落)第二次耐氧試驗:多個可疑菌落分別接種需氧和厭氧平皿,分別置35度作需氧和厭氧培養(yǎng).第三次耐氧試驗:取僅厭氧環(huán)境生長菌落分別在35度厭氧和需氧環(huán)境培養(yǎng),如分離的菌落僅在厭氧環(huán)境生長,可確定該菌為厭氧菌.,厭氧菌的鑒定步

13、驟和方法,耐氧試驗:3-4次耐氧試驗涂片革蘭染色生物特征:API 20A;Ripid 32; VITEK-32 ANI色譜分析分子生物學,直接涂片檢查,當有足夠的標本或收到兩個拭子時，最好在接種前做涂片革蘭染色鏡檢，檢查結果可提示需要接種哪些培養(yǎng)基（非常規(guī)使用的）。涂片檢查可看出有無細菌，微生物的類型和大概的數(shù)量以及芽胞、形狀和位置（芽胞梭菌）、著色情況及菌體特征。對血性液體或濃稠分泌物用丫啶橙染色比革蘭染色較易觀察。這些初

14、步結果應該及時向主管醫(yī)生報告，以幫助他們正確選用抗菌藥物。涂片檢查可核對培養(yǎng)結果是實驗室質量控制的一個重要指標。,,,,厭氧菌鑒定依據(jù) 根據(jù)菌體形態(tài)、染色反應、菌落性狀以及對某些抗生素的敏感性等作出初步鑒定。最后鑒定是一系列生化及終末代謝產(chǎn)物。 1．形態(tài)與染色 僅供參考，因不同培養(yǎng)基，不同菌齡其形態(tài)與染色性不同，厭氧培養(yǎng)時間往往較長，因有的G＋變?yōu)镚－。 2．菌落性狀 不同厭氧菌菌落形

15、狀和性質不同，梭菌的菌落特點是形狀不規(guī)則，而無芽胞厭氧菌多呈單個的圓形小菌落。,（1）  色素：產(chǎn)黑色素普魯沃菌培養(yǎng)2~10天可產(chǎn)生黑褐色或黑色色素，齲齒放線菌培養(yǎng)3~4天后產(chǎn)生粉紅色色素，奈氏放線菌延長培養(yǎng)時間可產(chǎn)生黃褐色色素。 （2）  溶血：產(chǎn)氣莢膜梭菌在新鮮血平板上可形成雙溶血圈，但同種的菌不同株則往往產(chǎn)生溶血性的差異，各細菌產(chǎn)生的溶血毒素不同，對不同動物紅細胞溶解亦有差異。 （3） 

16、; 熒光：產(chǎn)黑色素普魯沃菌，菌落在紫外線照射下，發(fā)出磚紅色熒光，梭桿菌常發(fā)生黃綠色熒光，艱難桿菌發(fā)生綠色熒光。 3. 耐氧試驗 厭氧菌必須做耐氧試驗,4. 藥物鑒定試驗 大多數(shù)類桿菌對卡那霉素耐藥，梭桿菌屬敏感，厭氧菌對滅滴靈敏感，非厭氧菌耐藥。 5. 聚茴香腦磺酸鈉（SPS）敏感試驗 厭氧消化鏈球菌對50g/L的SPS溶液敏感，而絕大多數(shù)其它G＋球菌耐藥 6. 生化特性 主要包括多種糖類

17、發(fā)酵試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗、觸酶試驗、卵磷脂酶試驗、脂肪酶試驗、蛋白溶解試驗、明膠液化試驗、膽汁內(nèi)肉湯生長試驗、硫化氫試驗，其方法多種多樣。,7. 氣液相色譜 氣液相色譜技術（GLC）是一種以氣體或液體為流動相，以涂固定液的載體為固定相。采用沖洗法的柱色譜分離技術。目前用來分析細菌終末代謝產(chǎn)物，結果可靠。 8．PCR、基因探針。,厭氧菌的鑒定,I級實驗室應達到的標準：根據(jù)耐氧試驗結果，革蘭染色，菌落特點提供厭

18、氧菌初步推斷報告。II級實驗室應達到的標準：根據(jù)革蘭染色反應，鏡下形態(tài)，菌落形態(tài)，耐氧試驗，用自制或國產(chǎn)傳統(tǒng)生化反應試劑定種。III級實驗室應達到的標準：除II級實驗室所選擇的鑒定方法外，能采用國際公認標準化鑒定系統(tǒng)。如API-20A、Micro ID、Vitek-ANI ，氣--液相色譜儀。,簡單步驟 (適用無條件作鑒定單位),床邊采樣或輸送培養(yǎng)基　　　　　┌────────────────────┼─────────

19、──────────┐　　　　 涂片記錄 　　　　　　厭氧血瓊脂 　　　　 需氧培養(yǎng) 染色不勻　　　　　平皿 羊血瓊脂

20、 典型厭氧菌 　　　　　48h35℃厭氧培養(yǎng) 　　　　　 中國藍瓊脂 形態(tài)可作一 　　　　　　│ 　　　　　　│ 初步報告 　　　　可疑菌落作耐氧試驗

21、 　　　　 24h 35℃需O2 ┌─────┴──────┐ 　　　　 ┌───┴───┐　　 　　　　　　 厭氧血碟 需氧血碟 　　　　 涂片 　　　 鑒定

22、 48h厭氧培養(yǎng) 24h需氧培養(yǎng)　 　　 ┌────┴────┐　　┌────┴────┐ 生長

23、 不生長 不生長 生長 繼續(xù)做第二次 非厭氧菌 可疑厭氧菌與厭氧 非厭氧菌 耐氧試驗

24、 培養(yǎng)對照決定 ┌──────┴──────┐ 　　　　　　 厭氧生長 需氧不生長 │ 涂片報告,報告方式,無條件作生物特征鑒定的實驗室：在三次耐氧試驗證明

25、菌株只能在厭氧生長者可用下面方式報告。如革蘭陰性厭氧球菌；革蘭陽性有芽胞桿菌，芽胞呈鼓捶壯；有條件實驗室應將細菌鑒定到種報告到種,9.厭氧菌的藥敏試驗,厭氧菌感染以經(jīng)驗用藥為主：* 厭氧菌對現(xiàn)已上市的藥物的敏感性有合理的預測性* 藥敏試驗報告時間太長（4～6天）厭氧菌藥敏試驗指征：* 嚴重感染，如心內(nèi)膜炎、腦膿腫、骨髓炎治療時期長，觀察藥 物敏感性變化。* 經(jīng)驗用藥無效* 對新藥評價*

26、 耐藥監(jiān)測,目前可推薦的厭氧菌藥敏方法,瓊脂稀釋法Etest法ATB-ANA試條,質控菌株MIC范圍,抗生素MIC范圍（μg/ml)________脆弱類桿菌多形類桿菌產(chǎn)氣莢膜桿菌ATCC25285ATCC29741ATCC13124阿莫西林/棒酸0.25～10.5～2--------氨芐西林/舒巴坦0.5～20.5～2--------頭孢西丁8～3232

27、～128--------頭孢替坦4～1632～128--------頭孢噻污8～3216～640.06～0.25頭孢曲松32～12864～256-------氯林可霉素0.5～22～80.03～0.12滅滴靈0.25～10.5～20.12～0.5氯霉素2～84～162～8亞胺培南0.03～0.120.06～0.250.03～0.12,菌種

28、保存技術要點：,（1）對需要長期保存的菌種，采用脫脂牛奶冷凍干燥方法進行保存，其復溶效果及細菌存活率較用肉湯、血漿等附形物要好；（2）對中短期保存的菌種，根據(jù)菌種的不同采用脫脂牛奶、血漿、全血、10%甘油、濾紙片、半固體瓊脂培養(yǎng)基及瓊脂平板傳代等方法進行保存；（3）菌種保存溫度的選擇，根據(jù)不同菌種選用室溫石蠟覆蓋法、室溫厭氧濕盒法、2℃~8℃、-30℃~-80℃冷藏保存等不同的條件進行保存。,參考菌株保存方法,高層瓊脂非苛養(yǎng)菌

29、瓊脂斜面現(xiàn)用菌株低溫速凍苛養(yǎng)細菌冷凍干燥長期保留菌株,1. 短期保存菌種：,一般細菌可采用半固體過夜培養(yǎng)覆蓋石蠟油（1cm厚）后，于4℃保存（假單胞菌于室溫保存），如有微生物自動鑒定儀可將鑒定卡片放低溫冰箱保存?？琉B(yǎng)性細菌和厭氧菌，可采用平皿傳代的方法保存。,2. 長期保存菌種：,冷凍干燥是長期保存細菌最好的方法。不常用的細菌最好凍干保存。經(jīng)?；蚨ㄆ谑褂玫模ㄓ袀鞔拗频模┚N，應采用多支分裝低溫冷凍保存，載體可根據(jù)條件進

30、行選擇（脫脂牛奶、血漿、全血、10%甘油、濾紙片等）。,3.厭氧菌的保存,冷凍真空干燥是最好的保存方法，但不易做到。 平皿傳代是較簡單且實用的方法。將需要保存的菌株接種于布氏血瓊脂平板上，放入?yún)捬豕蓿ɑ虼┲杏诜跸渲信囵B(yǎng)48小時后，放室溫陰涼處可保存兩個月。,,4. 細菌耐藥質粒的保存：,為了防止細菌耐藥質粒的丟失，應盡量減少菌種的傳代次數(shù)，最好與低溫冰箱中保存。在轉種帶有耐藥質粒的細菌時，應選用含有一定量的相應（耐藥）