細胞培養(yǎng)基本知識

1、細胞培養(yǎng)基本知識,根據(jù)《中華人民共和國傳染病防治法實施辦法》規(guī)定： 凡從事致病性微生物實驗的科研、教學(xué)和生產(chǎn)單位，作為各類傳染病菌（毒）研究操作的基本單元，實驗室必須有防止致病性微生物擴散的制度和人體防護措施。 不同危害群的微生物必須在不同的物理性防護的條件下進行操作，一方面防止實驗人員和其他物品受到污染，同時也防止其釋放到環(huán)境中。,傳染病原危害等級。第一級危害群微生物：與人類成人健康和疾病無關(guān)； （無或極低的個

2、體和群體危險）不太可能引起人或動物致病的微生物第二級危害群微生物：在人類所引起的疾病很少是嚴重的，而且通常有預(yù)防及治療的方法； （個體危險中等，群體危險低） 實驗室暴露也許會引起嚴重感染，但對感染有有效的預(yù)防和治療措施，并且疾病傳播的危險有限。 第三級危害群微生物：在人類可以引起嚴重或致死的疾病，可能有預(yù)防和治療的方法；第四級危害群微生物：在人類可以引起嚴重或致死的疾病，通常無預(yù)防和治療的方法，如炭疽桿菌、霍亂弧菌、埃博拉病毒、天

3、花病毒等。,隔離的設(shè)備、實驗室的設(shè)計及實驗實施等3個方面所組成. 根據(jù)其密封程度的不同，分為 P1、P2、P3和P4四個生物安全等級。  P是英文protect（保護）的縮寫。 四級生物安全（ P4）是生物安全實驗室等級最高的實驗室，可以有效阻止傳染性病原釋放到環(huán)境中，同時給研究人員提供生物安全的保證。實驗室可分： 基礎(chǔ)實驗室——一級生物安全水平、 基礎(chǔ)實驗室

4、——二級生物安全水平、 防護實驗室——三級生物安全水平 最高防護實驗室——四級生物安全水平。 根據(jù)操作不同危險度 ，等級微生物所需的實驗室設(shè)計特點、建筑構(gòu)造、防護設(shè)施、儀器、操作以及操作程序來決定實驗室的生物安全水平。有關(guān)的手冊有敘述： 與不同危險度等級相對應(yīng)的（而非“等同的”）各危險度等級微生物所要求的實驗室生物安全水平。,生物安全實驗室（P1、P2、P3、P4）,1 級

5、60;基礎(chǔ)實驗室—— 一級生物安全水平基礎(chǔ)的教學(xué)、研究,GMT 不需要；開放實驗臺,2 級 基礎(chǔ)實驗室——二 級生物安全水平 初級衛(wèi)生服務(wù)； 診斷、研究 GMT 加防護服、生物危 害標志 開放實驗臺，此外需 BSC 用于防護可能生 成的氣溶膠,,3 級 防護實驗室——三 級生物安全水平特殊的診斷、研 究 ，在二級生物安全防護水平上增加特殊防護服、 進

6、入制度、定向氣流BSC 和／或其他所有實驗室工作所需要的基本設(shè)備,4 級 最高防護實驗室——四級生物安全水平 危險病原體研究在三級生物安全防護水平上增加氣鎖入口、出 口淋浴、污染物品的特殊處理 Ⅲ級BSC 或Ⅱ級BSC。穿著正壓服、雙開門高壓滅菌器（穿過墻體）、經(jīng)過濾的空氣。 BSC ：生物安全柜；GMT ：微生物學(xué)操作技術(shù)規(guī)范,我國在生物安全方面也制定過一些

7、相應(yīng)的條例和法規(guī)。中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準（ WS233－2002）《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準則》中對生物安全三級（ P3）實驗室進行了規(guī)定。每個實驗室都應(yīng)該采用“安全手冊”或“操作手冊”，其中定義了已知的和潛在的危害，并規(guī)定了特殊的操作程序來避免或盡量減小這種危害。規(guī)范的微生物學(xué)操作技術(shù)是實驗室安全的基礎(chǔ)，而專門的實驗設(shè)備僅僅是一種補充，絕不能替代正確的操作規(guī)范。,在一級生物安全水平操作的微生物不

8、太可能引起人類疾病或獸醫(yī)學(xué)意義的動 物疾病。但理想的做法是，所有實驗室工作人員應(yīng)進行上崗前的體檢，并記錄其病史。疾病和實 驗室意外事故應(yīng)迅速報告，所有工作人員都應(yīng)意識到應(yīng)用規(guī)范的實驗室操作技術(shù)的重要性。 在二級生物安全水平操作微生物的實驗室工作人員 1 、必須有錄用前或上崗前的體檢。記錄個人病史，并進行一次有目的的職業(yè)健康評估。 2 、實驗室管理人員要保存工作人員的疾病和缺勤記錄。 3

9、60;、育齡期婦女應(yīng)知道某些微生物（如風(fēng)疹病毒）的職業(yè)暴露對未出生孩子的危害。,培訓(xùn),人為的失誤和不規(guī)范的操作會影響所采取的安全措施對實驗室人員的防護效果。因此，熟悉如何識別與控制實驗室危害的、有安全意識的工作人員，是預(yù)防實驗室感染、差錯和事故的關(guān) 鍵。 管理者應(yīng)確保將安全的實驗室操作及程序融合到工作人員的基本培訓(xùn)中。所有實驗室工作人員都會經(jīng)常遇到的高危操作，包括： 1 、吸入危險（氣溶膠產(chǎn)物），如使用接種環(huán)、

10、劃線接種瓊脂平板、移液、制作涂片、打開培養(yǎng)物、采集血液／血清標本、離心等 2 、食入危險，如處理標本、涂片以及培養(yǎng)物 3 、在使用注射器和針頭時刺傷皮膚的危險 4 、處理動物時被咬傷、抓傷 5 、處理血液以及其他有潛在病理學(xué)危害的材料 6 、感染性材料的清除污染和處理。,典型的二級生物安全水平實驗室 門保持關(guān)閉并貼上適當(dāng)?shù)奈ｋU標志。潛在被污染的廢棄物同普通廢

11、棄物隔開。 基本生物安全設(shè)備 1 、移液輔助器——避免用口吸的方式移液 2 、生物安全柜，在以下情況使用： —— 處理感染性物質(zhì)；如果使用密封的安全離心杯，并在生物安全柜內(nèi)裝樣、取樣，則 這類材料可在開放實驗室離心 —— 空氣傳播感染的危險增大時 —— 進行極有可能產(chǎn)生氣溶膠的操作時（包括離心、研磨、混勻、劇烈搖動、超聲破碎、打開內(nèi)部壓力和周圍環(huán)境壓力不同的盛放有感染

12、性物質(zhì)的容器、動物鼻腔接種以及從動物或卵胚采集感染性組織）。 3 、一次性塑料接種環(huán)，也可在生物安全柜內(nèi)使用電加熱接種環(huán)，以減少生成氣溶膠。 4 、螺口蓋試管及瓶子。 5 、用于清除感染性材料污染的高壓滅菌器或其他適當(dāng)工具。 6 、一次性巴斯德塑料移液管，盡量避免使用玻璃制品。 7 、在投入使用前，像高壓滅菌器和生物安全柜等設(shè)備必須用正確方法進行驗收。應(yīng)參照生產(chǎn)商的說明書定期檢

13、測。,廢棄物處理,首要原則：所有感染性材料必須在實驗室內(nèi)清除污染、高壓滅菌或焚燒。  用以處理潛在感染性微生物或動物組織的所有的實驗室物品，在被丟棄前應(yīng)考慮的主要問題有： 1 、是否已采取規(guī)定程序?qū)@些物品進行了有效的清除污染或消毒？ 2 、丟棄已清除污染的物品時，是否會對直接參與丟棄的人員，或在設(shè)施外可能接觸到丟棄物的人員造成任何潛在的生物學(xué)或其他方面的危害？ 3.清除污染 高

14、壓蒸汽滅菌是清除污染時的首選方法。需要清除污染并丟棄的物品應(yīng)裝在容器中。任何高壓滅菌后重復(fù)使用的污染（有潛在感染性）材料不應(yīng)事先清洗，任何必要的清洗、修復(fù)必須在高壓滅菌或消毒后進行。 也可采用其他除去／或殺滅微生物的替代方法 4.污染性材料和廢棄物的處理和丟棄程序 要對感染性物質(zhì)及其包裝物進行鑒別并分別進行處理，相關(guān)工作要遵守國家和國際規(guī)定。,合適的環(huán)境和必需的條件,,1,營養(yǎng)需要,,2,環(huán) 境 要 求,,,,3,無毒

15、及無污染,,,,無 毒：無毒是培養(yǎng)細胞的必需條件。凡與 細胞直接或間接接觸的東西都必須 是無毒的。,無污染,,微生物的污染,不同細胞類型的交叉污染,,細菌,霉菌,支原體等,實驗準備,實驗用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板， 凍存

16、管,,日本三洋CO2培養(yǎng)箱,倒置像差生物顯微鏡,超凈工作臺,自動雙重純水蒸餾器 純水儀,濾 器,酶標儀 微孔板震蕩器,培 養(yǎng) 板 及瓶,清洗,在組織細胞培養(yǎng)中，體外細胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感,均能影響培養(yǎng)細胞的生長微生物產(chǎn)品附帶雜物上次細胞殘留物非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)需要清洗的培養(yǎng)用品玻璃器皿的清洗膠塞的清

17、洗塑料制品的清洗,玻璃器皿的清洗,包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟 浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、流水沖洗、 60℃烘干、酸泡（24小時）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、60℃烘干清洗后的玻璃器皿干凈透明無油跡不能殘留任何物質(zhì),浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細胞有害的物

18、質(zhì)等先用自來水簡單刷洗，然后用5％稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上,刷洗：用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度,浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液

19、面浸泡時間：一般為過夜，不應(yīng)少于6 小時清潔液 常用三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml） 強清潔液 63∶1000∶200 次強清洗液 120∶ 200∶1000 弱清潔液 100∶ 100∶1000配制時應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成

20、后清潔液一般為棕紅色,沖洗在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或清潔液的殘跡最好用洗滌裝置如用手工操作需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5 次，晾干備用,膠塞的清洗,新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理常規(guī)清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分鐘（以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)），自來水沖洗，蒸餾水沖洗2-3次，晾干備

21、用,塑料制品的清洗,塑料制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品必要時用2% NaOH 浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30 分鐘，最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用 本實驗： 自來水洗、蒸餾水洗、蒸餾水煮、甩干水、干燥、裝盒； 消毒。,消毒,細胞培養(yǎng)的最大危險是發(fā)生培養(yǎng)物的細菌、真菌和病毒等微生物的污染常見原因：操作間或周圍空間的不潔培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格

22、或不徹底由于有關(guān)培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染,消毒滅菌方法,物理消毒滅菌法紫外線：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒的培養(yǎng)器皿，30min濕熱（高壓蒸氣滅菌法）：121℃，20min干烤：160℃, 2 小時過濾：0.22μm化學(xué)消毒滅菌法70%酒精主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理1‰新潔爾滅主要用于器械的浸泡及皮膚和操作室

23、壁面的擦試消毒抗生素主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染,細胞培養(yǎng)基應(yīng)用選擇,選擇培養(yǎng)基沒有一定的標準，有幾點建議可供參考： (1 ）建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I，或在購買細胞株時咨詢。 (2) 其它實驗室慣用的培養(yǎng)基不妨一試，許多培養(yǎng)基可以適合多種細胞。 (3) 根據(jù)細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基。如小鼠細胞株多選 RPMI1640 。 (4) 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，

24、觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標準型）、DMEM-高糖（標準型）、DMEM-低糖（標準型）、McCoys 5A、M199、F10等,制備1000mlRPMI 1640培養(yǎng)基,RPMI 1640 干粉培養(yǎng)基10.4g（1包） 蒸餾水 400ml 　　　↓　 磁力攪拌至完全溶

25、解  　　　↓　 加三蒸餾水定容至1000ml 在超凈臺內(nèi)無菌條件下，用滅菌后的并置有0.22μm孔徑濾膜的過濾器除菌，并分裝成200ml/瓶，-20℃保存?zhèn)溆谩?用前取一瓶溶解，每200ml培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。再加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100U/ml。 ------- 細胞培養(yǎng)液,胰蛋白酶溶液： 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去

26、細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。 胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。 用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用,稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks 平衡鹽溶液調(diào)成糊狀，再補足D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4 小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中， -

27、20℃保存?zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐В?，常用濃度?.25% （0.1%-0.5%）胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 至7.2 左右,胰蛋白酶溶液配制,D-Hanks’ 平衡鹽溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS),血清,熱滅活：56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清熱滅活目的：滅活血清中的補體成分。如果不做細胞因子和免疫相關(guān)的實驗，建議血清不要滅活。  因為熱處

28、理會造成血清沉淀物顯著增多，還會影響血清的質(zhì)量。滅活后嚴重影響細胞生長速度，且細胞貼壁率降低。血清中的沉淀物絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量。可用離心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理顯微鏡下“小黑點”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立

29、即停止使用，更換另一批號的血清,血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56 ℃ ，30 分鐘血清的消毒：過濾除菌,EDTA·4Na 溶液,一種化學(xué)螯合劑，對細胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。注意：使用E

30、DTA 處理細胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA 會影響細胞生長EDTA 溶液配制：用D-Hanks’ 平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4℃冰箱保存,消化液,分離組織和分散細胞常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液單獨或混合使用,pH 調(diào)整液,NaHCO3 溶液常用濃度為7.5%。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存HEPES（分子量238.31）溶液一種弱酸，中文名

31、字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性主要作用:防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES使用終濃度一般為10-50mmol/L常配成1M 儲存液：用20ml 雙蒸水溶解4.76克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入2ml HE

32、PES濃縮液，終濃度為20mmol/L,抗菌素的使用： 在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。 慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定,器材和液體的準備,細胞培養(yǎng)用的玻璃器材培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，160℃，2小時干烤或15磅，121℃，

33、20分鐘蒸氣滅菌后備用手術(shù)器材、瓶塞、配制好的PBS液15磅，121℃，20分鐘蒸氣滅菌MEM培養(yǎng)液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾后備用,完全培養(yǎng)基的組成,基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80％一95％血清 5％一20％碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素

34、 各100卑位／毫升,無菌操作中的注意事項,在無菌操作中，一定要保持工作區(qū)的無菌清潔操作前無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10 分鐘操作時，小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用 在整個無菌操作過程中都應(yīng)