白皮松體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究.pdf

1、白皮松(PinusbungeanaZucc.)為我國(guó)特有的鄉(xiāng)土樹種，也是我國(guó)北方園林綠化與生態(tài)工程造林的優(yōu)良樹種。本研究以白皮松未成熟合子胚以及成熟合子胚為外植體，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生。系統(tǒng)研究了白皮松體胚發(fā)生所涉及的各種影響因素，以及體胚發(fā)生過(guò)程中的生理生化特性。研究結(jié)果將為白皮松優(yōu)良無(wú)性系繁殖、基因保存、遺傳改良以及人工種子生產(chǎn)等方面奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。具體結(jié)果如下： 1.BM1、DCR1和改良MS三種培養(yǎng)基相比，接種于DCR

2、1的未成熟合子胚生長(zhǎng)迅速，愈傷組織較大，分化能力較強(qiáng)。DCR1培養(yǎng)基的平均胚性愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到56.59％，說(shuō)明DCR1培養(yǎng)基最適合進(jìn)行白皮松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。 2.白皮松胚性愈傷組織在含有較高濃度生長(zhǎng)素2，4-D和較高濃度的細(xì)胞分裂素6-BA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率較高。不同濃度的2，4-D和6-BA對(duì)白皮松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率均存在極顯著差異，2，4-D和6-BA的組合存在交互作用并對(duì)其胚性愈傷組織誘導(dǎo)有顯著影響。多重比較可知6

3、mg·L-12，4-D+2mg·L-16-BA為誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳激素濃度組合。 3.不同發(fā)育時(shí)期的未成熟合子胚誘導(dǎo)率差異很大。6月30日采摘合子胚的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率明顯高于其他四個(gè)時(shí)期，最高達(dá)到97.22％，平均誘導(dǎo)率為76.23％。 4.7月30日和8月10日采集的白皮松成熟合子胚很難誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。個(gè)別外植體產(chǎn)生的愈傷組織經(jīng)繼代培養(yǎng)后生長(zhǎng)勢(shì)也較弱，不能進(jìn)一步分化成胚性細(xì)胞。 5.0.3mg·L-1

4、2，4-D+0.2mg·L-1NAA為胚性愈傷組織保持和增殖的最佳激素組合濃度。2，4-D與NAA的交互作用對(duì)胚性愈傷組織增殖存在顯著影響。 6.繼代方式對(duì)胚性愈傷組織增殖率有顯著影響。以固體/液體交替培養(yǎng)的方式進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖率可達(dá)88.89％。 7.培養(yǎng)在附加9000mg·L-1肌醇和0.1mg·L-1IBA的DCR1增殖培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織將形成后期原胚。加入低濃度的IBA，能使更多的胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)化成具胚柄胚性

5、細(xì)胞團(tuán)。 8.蔗糖濃度的變化對(duì)白皮松體細(xì)胞胚的成熟發(fā)育有著極顯著影響。含有50g·L-1蔗糖和0.1mg·L-1IBA的DCR1培養(yǎng)基最適合白皮松體細(xì)胞胚的成熟誘導(dǎo)，該組合明顯提高了白皮松體細(xì)胞胚的成熟頻率。 9.在10mg·L-1ABA+75g·L-1PEG的DCR1培養(yǎng)基上，體細(xì)胞成熟率最高，達(dá)到27.78％。 10.在體胚誘導(dǎo)過(guò)程中，胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織可溶性蛋白質(zhì)，可溶性糖和淀粉含量呈現(xiàn)出不同的變

6、化趨勢(shì)。胚性愈傷組織中可溶性蛋白質(zhì)含量在培養(yǎng)5d到25d時(shí)急劇上升，到25d時(shí)達(dá)到最大值為5.7509mg·gFW-1，之后其含量下降；非胚性愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中可溶性蛋白的含量變化不明顯。胚性愈傷組織可溶性糖隨著培養(yǎng)天數(shù)的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，培養(yǎng)25d時(shí)達(dá)到了峰值36.5831mg·gFW-1，隨后就呈下降趨勢(shì)；非胚性愈傷組織可溶性糖含量在培養(yǎng)15d時(shí)達(dá)到了最大值，隨后其含量也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。胚性愈傷組織淀粉含量變化呈現(xiàn)出先上升在下降然后又

7、上升的趨勢(shì)；非胚性愈傷組織淀粉含量隨著培養(yǎng)時(shí)間整體呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，其含量從17.1460mg·gFW-4下降到10.5976mg·gFW-1。 11.胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織SOD活性的變化趨勢(shì)基本一致，即誘導(dǎo)培養(yǎng)15d出現(xiàn)峰值，然后酶活性下降。CAT活性變化趨勢(shì)不一致，胚性愈傷組織培養(yǎng)25d時(shí)達(dá)到峰值，非胚性愈傷組織培養(yǎng)15d時(shí)達(dá)到峰值，然后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其CAT活性逐漸下降。胚性愈傷組織POD酶活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)