動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)

1、2.2 動(dòng)物細(xì)胞工程,生產(chǎn)單克隆抗體等,動(dòng)物細(xì)胞工程常用的技術(shù),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),動(dòng)物細(xì)胞核移植,動(dòng)物細(xì)胞融合,是其他動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)。,一.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng),如何進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)?,2.2.1動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù),從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)組織，將它們分散成單個(gè)細(xì)胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。,(一)概念,閱讀P44-P45頁(yè)回答問(wèn)題,問(wèn)題1：試說(shuō)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)大致過(guò)程、原理,(二) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程,胚胎或幼齡動(dòng)物的器官、

2、組織,,細(xì)胞懸液,10-50代細(xì)胞,,,,剪碎,胰蛋白酶或膠原蛋白酶,胰蛋白酶處理分瓶培養(yǎng),原代培養(yǎng),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成生物體,細(xì)胞增殖緩慢，核型可能變化,貼壁生長(zhǎng)接觸抑制,10代以內(nèi)，保持正常二倍體核型,傳代培養(yǎng),,單個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)液,原理：　有絲分裂,問(wèn)題4：為什么用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理？,問(wèn)題2：、為什么選用動(dòng)物胚胎或幼齡個(gè)體的器官或組織做動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)材料？,因?yàn)槠浼?xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)，分化程度低。,問(wèn)題3、為

3、什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞？,分散成單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞群（團(tuán)）后容易培養(yǎng)，細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)容易供應(yīng)，其代謝廢物容易排出,動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，胰蛋白酶處理動(dòng)物組織，可以使動(dòng)物組織細(xì)胞間的蛋白質(zhì)和細(xì)胞外的其他成分酶解，獲得單個(gè)細(xì)胞。,問(wèn)題5：為什么用胰蛋白酶處理而不用胃蛋白酶？,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適PH值為7.2-7.4，胰蛋白酶作用的適宜PH為7.2-8.4，胃蛋白酶適宜PH為2.胃蛋白酶在PH為7.2-

4、7.4的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中無(wú)活性。,問(wèn)題6：用胰蛋白酶處理不會(huì)把所培養(yǎng)的細(xì)胞消化掉嗎？,控制好時(shí)間！長(zhǎng)時(shí)間處理當(dāng)然會(huì)損傷細(xì)胞。,當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞處于接觸抑制后, 用胰蛋白酶處理,使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來(lái),然后加入新的培養(yǎng)液,將細(xì)胞分離稀釋,并從原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),這個(gè)過(guò)程稱傳代培養(yǎng).（分瓶培養(yǎng)的過(guò)程）,②傳代培養(yǎng),①原代培養(yǎng),定義：人們通常將動(dòng)物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。,強(qiáng)調(diào)一：原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng),,原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)、細(xì)

5、胞株和細(xì)胞系（了解）,,,,▲細(xì)胞株：傳代細(xì)胞一般能傳到40-50代，遺傳物質(zhì)一般不會(huì)發(fā)生改變，叫細(xì)胞株。,,▲細(xì)胞系：傳代50代以后，部分細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，能無(wú)限增殖，獲得不死性，叫細(xì)胞系。,強(qiáng)調(diào)二：細(xì)胞貼壁過(guò)程,■細(xì)胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁。,■培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無(wú)毒、易于帖附。,■當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長(zhǎng)到表面相互接觸時(shí),細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。,強(qiáng)調(diào)

6、三：接觸抑制,多細(xì)胞動(dòng)物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境的知識(shí)，思考以下問(wèn)題： 1.體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要提供哪些物質(zhì)？ 2.體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要什么樣的環(huán)境條件？,P46討 論,充足營(yíng)養(yǎng)（糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、無(wú)機(jī)鹽、微量元素等合成成分及血清、血漿等天然成分。）,適宜溫度、PH和氣體環(huán)境；無(wú)菌無(wú)毒環(huán)境,(三) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件P46,1、無(wú)菌、無(wú)毒環(huán)境（無(wú)菌處理和添加抗生素目的？

7、更換培養(yǎng)液的好處？）,2、營(yíng)養(yǎng):與體內(nèi)相同，液體合成培養(yǎng)基：糖、氨基酸、促生長(zhǎng)因子、水、無(wú)機(jī)鹽、微量元素等，通常需加入血清、血漿等一些天然成分。,3、溫度和PH,4、氣體環(huán)境95%空氣、5%CO2--維持培養(yǎng)液PH,適宜的溫度：人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞最適溫度為36.5±0.5℃。適宜的酸堿度：PH：7.2-7.4,,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？,主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、無(wú)機(jī)鹽）、維生素

8、和動(dòng)物血清等。獨(dú)特之處有：1、液體培養(yǎng)基 2、成分中有動(dòng)物血清等,P47最上面1、大規(guī)模的生產(chǎn)生物制品。2、培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞作為基因工程的受體細(xì)胞。3、檢測(cè)判斷物質(zhì)的毒性。4、培養(yǎng)正?；蚋鞣N病變的細(xì)胞，用于生理、病理、藥理等方面的研究，如用于 等，為 及其他疾病提供理論依據(jù)。,(四) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用,篩選抗癌藥物,治療和預(yù)防癌癥,植物組織培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的比較,我收

9、獲了什么？,背誦1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程、注意問(wèn)題2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件、注意問(wèn)題3、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)的比較,相互接觸,接觸抑制,單層,胰蛋白酶,衰老或死亡,不死性,降低,減少,活細(xì)胞的膜具有,選擇透過(guò)性，大分子染料不能進(jìn)入細(xì)胞，故不染色。,中,低溫,新陳代謝,酶,抗原,二.動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動(dòng)物,將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成為一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體（

10、克隆動(dòng)物）,分類,細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易,,細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)全能性不容易,(一)、 動(dòng)物細(xì)胞核移植概念：,,(二)、體細(xì)胞核移植的過(guò)程：,請(qǐng)看教材P48圖2-21,思考：1.核移植的受體細(xì)胞是什么？處在什么時(shí)期？用此細(xì)胞作為受體細(xì)胞有什么好處？2.通過(guò)什么手段激活受體細(xì)胞，構(gòu)建重組胚胎？,MⅡ中期卵母細(xì)胞,誘導(dǎo)方法：物理或化學(xué)方法激活受體細(xì)胞，完成細(xì)胞分裂和發(fā)育進(jìn)程。,卵母細(xì)胞體積大，便于操作；含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐

11、富，提供早期胚胎發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)；含有激活細(xì)胞核體現(xiàn)全能性的物質(zhì)。,(二)、體細(xì)胞核移植的過(guò)程：,P49討論：,1.在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？,為使核移植的胚胎或動(dòng)物的遺傳物質(zhì)全部來(lái)自有重要利用價(jià)值的動(dòng)物提供的體細(xì)胞，在供體細(xì)胞的細(xì)胞核移至受體細(xì)胞之前，必須將受體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐?P49小資料）。,培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞一般當(dāng)傳代至10～50代左右時(shí)，部分細(xì)胞核型可能會(huì)發(fā)生變化，

12、其細(xì)胞遺傳物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細(xì)胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細(xì)胞核移植中，為了保證供體細(xì)胞正常的遺傳基礎(chǔ)，通常采用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞。,2.用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞，想一想，這是為什么？,3.你認(rèn)為用上述體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動(dòng)物，是對(duì)體細(xì)胞供體動(dòng)物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？,絕大部分DNA來(lái)自于供體細(xì)胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體中的DNA是來(lái)自于受體

13、卵母細(xì)胞。,此外，即便動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)完全相同，但動(dòng)物的一些行為、習(xí)性的形成與所處環(huán)境有很大關(guān)系，核供體動(dòng)物生活的環(huán)境與克隆動(dòng)物所生活的環(huán)境不會(huì)完全相同，其形成的行為、習(xí)性也不可能和核供體動(dòng)物完全相同，從這一角度看，克隆動(dòng)物不會(huì)是核供體動(dòng)物100%的復(fù)制。,(三)、體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景：,1、在畜牧業(yè)中可以加速家畜遺傳改良的進(jìn)程,2、保護(hù)瀕危物種,3、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)及組織器官的移植,4、了解胚胎發(fā)育和衰老過(guò)

14、程；追蹤研究疾病的發(fā)展過(guò)程和治療疾病,閱讀課本P50頁(yè),(四)、體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問(wèn)題：,思考與探究,1.幼齡與老齡動(dòng)物的組織細(xì)胞比較，分化程度低的與分化程度高的組織細(xì)胞比較，哪一種更易于培養(yǎng)？思考一下，這是什么道理？,提示：細(xì)胞的衰老與動(dòng)物機(jī)體的衰老有著密切的關(guān)系，細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動(dòng)物細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，有絲分裂旺盛，老齡動(dòng)物則相反。所以，一般來(lái)說(shuō)幼年動(dòng)物的組織細(xì)胞比老年動(dòng)物的組織細(xì)胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細(xì)胞的

15、分化程度越低，則增殖能力越強(qiáng)，所以更容易培養(yǎng)。,思考與探究,2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)脫分化的過(guò)程嗎？為什么？,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不需經(jīng)過(guò)脫分化過(guò)程。因高度分化的動(dòng)物細(xì)胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，所以，動(dòng)物細(xì)胞也就沒(méi)有類似植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的脫分化過(guò)程了。要想使培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動(dòng)物干細(xì)胞，使其分化成所需要的組織或器官。,3.1997年，美國(guó)威斯康星州的一個(gè)奶牛場(chǎng)有一頭名叫盧辛達(dá)（Lucinda）的奶牛，

16、年產(chǎn)奶量為30.8 t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀(jì)錄。目前世界各國(guó)高產(chǎn)奶牛場(chǎng)奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般為十幾噸，而我國(guó)奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為3～4 t。（1）能利用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)嗎？請(qǐng)說(shuō)明理由。,可以。盧辛達(dá)的產(chǎn)奶量很高，有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達(dá)的體細(xì)胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來(lái)自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到

17、很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進(jìn)程。,該克隆牛不能無(wú)限制地推廣，其數(shù)量不宜過(guò)多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無(wú)限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。,（2）如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)的任務(wù)交給你，你將如何對(duì)它進(jìn)行克??？,從盧辛達(dá)耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易取）上剪取一小塊組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細(xì)胞。從屠宰場(chǎng)取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟。用顯微針去除卵母細(xì)胞的核，再將耳細(xì)胞注入卵母細(xì)胞，

18、用電刺激方法使卵母細(xì)胞與體細(xì)胞融合，這時(shí)供體核就進(jìn)入了受體卵母細(xì)胞，再用電刺激或化學(xué)物質(zhì)激活注入了體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞，使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育過(guò)程。核移植胚胎在體外短時(shí)間培養(yǎng)后，挑選正常卵裂的胚胎植入經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛體內(nèi)。,4.體細(xì)胞核移植技術(shù)在研究和應(yīng)用上還存在什么問(wèn)題？請(qǐng)你查閱資料，了解這方面的前沿動(dòng)態(tài)。,研究方面：克隆動(dòng)物基因組重新編程的機(jī)制尚不清楚，克隆技術(shù)效率低，克隆動(dòng)物畸形率高、死亡率高、易出現(xiàn)早衰等問(wèn)題。這些問(wèn)題尚在