級組織學技術課件

1、組織學技術——概述、切片制備,付文玉fuwenyu.2007@163.com2008.9.10,概 述,光鏡技術石蠟切片術（paraffin sectioning）蘇木精-伊紅染色,簡稱HE染色（hematoxylin-eosin staining）,HE染色，腦垂體,掃描電鏡術（scanning electron microscopy,SEM）：觀察組織細胞表面結構,電鏡技術,透射電鏡術（transmission

2、 electron microscopy,TEM）：觀察細胞內部結構,Transmission Electron Microscope,漿細胞,血細胞,組織化學技術,一般組織化學 （Classical histochemistry） 免疫組織化學 （immunohistochemistry） 原位雜交 （in situ hybridization),兔肝PAS反應,圖像分析術-形態(tài)計量術,應用數(shù)學或統(tǒng)計學原理對組織切片提

3、供的平面圖像進行分析，從而獲得立體的組織和細胞內各種有形成分的數(shù)量、體積、表面積等參數(shù)，從量的角度顯示結構和功能的關系。,細胞培養(yǎng)術和組織工程,細胞培養(yǎng)術：把從機體取得的細胞在體外模擬體內的條件下進行培養(yǎng)的技術。,組織工程：細胞培養(yǎng)術在體外模擬構建機體組織或器官的技術。,實驗中的組織工程耳,石蠟切片的制備,基本操作步驟,取材、固定,洗滌、脫水,透 明,浸蠟、包埋,切 片,染 色,脫水、透明、封片,,,,,,,,一、取材、固定,1.動

4、物致死法,麻醉 空氣栓塞 頸椎脫臼或斷頭 股動脈放血,（一）取材,2.動物選擇,根據教學或科研目的和要求確定。,3.取材方法,取材順序 先腹腔，后胸腔、盆腔，最后取神經系統(tǒng),肌組織：縱切后結扎固定，以防因收縮而出現(xiàn)波浪形變化。取縱、橫切面；肝臟：右前葉或左外葉中部。縱切或冠狀切面；膽囊：取膽囊體部，附于濾紙，洗去膽汁后固定；,組織、器官取材舉例,胰腺：取含有較多胰島的胰尾部。胃：取胃底或胃體。附于濾紙，防止卷縮；腎臟：縱

5、剖，再做扇形切面，皮、髓質均有。,,,4.外科活體組織取材,臨床手術取材：多用于腫瘤組織。包括腫瘤及其周圍組織；活體小組織：包埋時注意切片的面，因體積較小，仔細操作,5.取材注意事項,動作輕、快，保證組織新鮮; 保持組織清潔; 力求組織塊小而薄; 一刀切取，避免擠壓; 盡量保持組織原有形狀; 部位準確，切面合適; 切除不需要的部分,（二）固定,1.意義和目的,使要觀察的組織結構盡量接近于生前的正常狀態(tài)。,防止組織

6、細胞死后的變化和自溶； 使細胞內的可溶成分轉變?yōu)椴蝗苄晕镔|； 使細胞內成分沉淀、凝固后產生不同的 折射率和對染料的親和力； 增加組織硬度，利于切片； 防止組織過度收縮或膨脹,2.注意事項,動作迅速，保持組織新鮮； 防止組織因固定而發(fā)生變形； 使用新配制的固定劑； 固定劑的用量:組織塊體積的10- 15倍 ；,固定的時間依組織的種類、性質、大小、固定劑的種類、性質、滲透力而定；固定過程中時常搖動；作好記錄，組織

7、名稱、固定液、時間等,3.固定液的種類,單純固定液 甲醛、乙醇、苦味酸、丙酮、氯化汞、等,混合固定液 Carnoy液、Bouin液、Zenker液等,4.固定的方式,特殊固定法,常規(guī)固定法,二、洗滌、脫水、透明、浸蠟、 包埋,方法固定液以水配制者——流水沖洗；固定劑含乙醇者——不沖洗，或用與固定劑中乙醇濃度相近的乙醇沖洗；特殊固定液洗滌法,（二）脫水,目的和原則 用某些溶劑逐步將組織塊吸收的水分置換出來，以利于透明劑

8、和石蠟或火棉膠的滲入。,種類和效果 非石蠟溶劑的脫水劑：乙醇、丙酮等脫水兼石蠟溶劑的脫水劑：正丁醇和環(huán)氧六烷等,（三）透明,目的 便于透蠟包埋。大多數(shù)脫水劑與石蠟不相混合，通過透明劑的作用才能透蠟。,種類 二甲苯、苯、甲苯、氯仿等。,（四）浸蠟（透蠟）,目的和方法 脫水、透明后的組織用石蠟、火棉膠、明膠等支持劑透入其內部，替代組織中的透明劑，并滲入組織內部使軟組織變?yōu)檫m當硬度的蠟塊，以利于切片和觀察。,浸蠟劑的種類 石蠟、火

9、棉膠、明膠等,（五）包埋,1.石蠟包埋法—常用的方法,浸蠟,,54-56℃,56-58℃,,,,2.快速石蠟包埋法—用于快速診斷,包埋過程,包埋注意事項,3.火棉膠包埋法—用于大塊組織和眼球,4.碳蠟包埋法、明膠包埋法—不常用,三、組織制片法-切片,（一）石蠟切片法,1.切片前的準備工作,載波片的處理；防脫片劑的選擇；修塊；備刀,2.切片過程,3.石蠟切片常遇到的問題及解決的方法,4.切片注意事項,（二）冰凍切片法,1.制備石蠟切

10、片的基本步驟。2.組織取材和固定的注意事項。,,思考,四、染 色,將染料配成溶液，將組織切片浸入染色劑中，使組織、細胞等成分被染上深淺不同的顏色，產生不同的折光率，便于在光鏡下觀察。,1.目的,2.染料特性,染料是有機化合物，在其分子結構中有特殊功能的基團，發(fā)色團和助色團。,4.常規(guī)染色技術—HE染色,蘇木精（Hematoxylin）為堿性染料，能將細胞核染成藍色 ；伊紅（Eosin）為酸性染料，常將細胞質染成紅色,HE染色的步驟和

11、方法,藍化,充分水洗,分色,伊紅染色,,,,水洗,脫蠟,蘇木精染色,水洗,復水,水洗,,,,,脫水,透明,封片,,,,,,脫蠟： 二甲苯I、II，脫蠟必須徹底；復水：梯度酒精，洗去溶解的石蠟和二甲苯；水洗：普通水洗，蒸餾水洗；蘇木精染色：染色時間10-15min；水洗：普通水洗凈染液；分色：鹽酸酒精分色，將過染或不需 要染色的組織成分除去；水洗：普通水洗凈染液；,氨水藍化：使細胞核進一步變藍；充分水洗：洗去鹽酸酒精，終止