喹啉與青蒿素類抗瘧藥物的分析副本

1、教學(xué)目的與要求,掌握喹啉與青蒿素類抗瘧疾藥物的鑒別試驗(yàn)和含量測(cè)定方法。掌握喹啉與青蒿素類抗瘧疾藥物的基本結(jié)構(gòu)和主要性質(zhì)。了解喹啉與青蒿素類抗瘧疾藥物的雜質(zhì)檢查要求。,瘧疾（Malaria）經(jīng)按蚊叮咬而感染瘧原蟲所引起的蟲媒傳染病。臨床以周期性寒戰(zhàn)、發(fā)熱、頭痛、出汗和貧血、脾腫大為特征。兒童發(fā)病率高，大都于夏秋季節(jié)流行。瘧原蟲寄生于人體所引起的傳染病。經(jīng)瘧蚊叮咬或輸入帶瘧原蟲者的血液而感染。不同的瘧原蟲分別引起間日瘧、三日瘧、惡性瘧及

2、卵圓瘧。本病主要表現(xiàn)為周期性規(guī)律發(fā)作，全身發(fā)冷、發(fā)熱、多汗，長(zhǎng)期多次發(fā)作后，可引起貧血和脾腫大。瘧疾是由瘧原蟲引起的寄生蟲病，于夏秋季發(fā)病較多。在熱帶及亞熱帶地區(qū)一年四季都可以發(fā)病，并且容易流行。,抗瘧藥（antimalarial drugs）是防治瘧疾的重要手段。現(xiàn)抗瘧藥中尚無(wú)一種能對(duì)瘧原蟲生活史的各個(gè)環(huán)節(jié)都有殺滅作用。因此，必須了解各種抗瘧藥對(duì)瘧原蟲生活史的不同環(huán)節(jié)的作用，以便根據(jù)不同的目的正確選擇藥物。各種抗瘧藥通過(guò)影響瘧原蟲生活

3、史的不同發(fā)育發(fā)揮基抗瘧效果。,抗瘧藥分類為：1、主要用于控制瘧疾癥狀的抗瘧藥，如：氯喹、奎寧等。它們通過(guò)殺滅紅細(xì)胞內(nèi)期的裂殖體，中斷瘧原蟲的無(wú)性生殖周期，發(fā)揮控制癥狀發(fā)作和癥狀抑制性預(yù)防作用。2、主要用于防止瘧疾復(fù)發(fā)與傳播的抗瘧藥，如伯氨喹等。它們通過(guò)殺滅間日瘧繼發(fā)性紅細(xì)胞外期的子孢子及各種瘧原蟲的配子體，控制瘧疾的復(fù)發(fā)和傳播；3、主要用于預(yù)防瘧疾的抗瘧藥，如乙胺嘧啶等。它們通過(guò)殺滅原發(fā)性紅細(xì)胞外期的瘧原蟲，發(fā)近病因性預(yù)防作用；

4、4、與抗瘧藥聯(lián)合應(yīng)用的藥物；5、其他類抗瘧藥。,第一節(jié) 喹啉類藥物的分析 共同點(diǎn)：含有吡啶與苯稠合而成的喹啉環(huán)，環(huán)上的雜原子的反應(yīng)性能基本與吡啶相同。 典型藥物有：硫酸奎寧、二鹽酸奎寧、鹽酸氯喹、磷酸哌喹等,,磷酸咯萘啶,,,脂環(huán)氮，堿性強(qiáng)， pKa 8.8,可以與硫酸成鹽,芳環(huán)氮，堿性較弱， pKa 4.2,不能與硫酸成鹽,4. 紫外吸收光譜特征 由于喹啉類藥物分子結(jié)構(gòu)中含有吡啶與苯稠合而成的喹啉雜環(huán)，具有共

5、軛體系，可用紫外吸收光譜的特征鑒別該類藥物。,二、鑒別試驗(yàn)（一）綠奎寧反應(yīng) 含氧喹啉衍生物的特征反應(yīng) 硫酸奎寧和二鹽酸奎寧都顯綠奎寧反應(yīng)。,微過(guò)量,翠綠色可轉(zhuǎn)溶于醇、氯仿中不溶于醚,,,奎尼丁,（二）光譜特征1、紫外吸收光譜：示例：?磷酸氯喹---在4個(gè)波長(zhǎng)處有最大吸收 ?磷酸咯萘啶—在2個(gè)波長(zhǎng)處有最大吸收鹽酸環(huán)丙沙星：取本品，加0.1mol/L鹽酸溶液制成每1ml中含8μg的溶液，照分光光度法(附錄Ⅳ

6、 A)測(cè)定，在 277nm與315nm的波長(zhǎng)處有最大吸收。 2、熒光光譜－在稀硫酸溶液中顯藍(lán)色熒光（特征鑒別方法） 硫酸奎寧：取本品約20mg，加水20ml溶解后，分取溶液10ml，加稀硫酸使成酸 性，即顯藍(lán)色熒光。,3、紅外吸收光譜特征,1、硫酸鹽的鑒別反應(yīng) （1）滴加氯化鋇試液 白色沉淀； 分離，沉淀在鹽酸或硝酸中不溶 （2）滴加醋酸鉛試液 白色沉淀； 分離，沉淀溶于醋

7、酸銨或氫氧化鈉試液 （3）加鹽酸，無(wú)白色沉淀（區(qū)別于硫代硫酸鹽）,,,2、氯化物的鑒別（1）硝酸酸性下，滴加硝酸銀試液 白色凝乳狀沉淀 ；分離，沉淀溶于氨試；加稀硝酸酸化液；又出現(xiàn)沉淀（2）加與供試品等量的二氧化錳，混勻，加硫酸濕潤(rùn)，緩緩加熱，產(chǎn)生氯氣，使?jié)駶?rùn)的碘化鉀淀粉試紙顯藍(lán)色,,3、磷酸鹽的鑒別反應(yīng)（1）中性供試品溶液中，加硝酸銀試液，生成淺黃色沉淀；分離，沉淀易溶于氨試液或稀硝酸（2）加氯化銨試液，生成白色

8、結(jié)晶性沉淀（3）加鉬酸銨試液和硝酸，加熱，產(chǎn)生黃色沉淀；分離，沉淀在氨試液中溶解,三、特殊雜質(zhì)的檢查（一）硫酸奎寧中有關(guān)物質(zhì)的檢查 奎寧從金雞納樹(shù)皮中提取，提取分離過(guò)程中可能帶入其他金雞納堿雜質(zhì)。 臨床上使用的藥物為硫酸奎寧片和二鹽酸奎寧注射劑,硫酸鹽難溶于水,多制成片劑,二鹽酸鹽水溶性好，可制成注射劑,1、酸度 目的：檢查控制藥物中的酸性物質(zhì)，主要為成鹽過(guò)程中引入 方法：取本品0.2g，加水20m

9、l溶解后，測(cè)定pH值應(yīng)為5.7 ～6.6,2、氯仿—乙醇中的不溶物 原理：溶解行為的差異 主要雜質(zhì)： 制備過(guò)程中引入的無(wú)機(jī)鹽與其他生物堿 檢查方法:取本品2g，加氯仿－無(wú)水乙醇 (2:1) 的混合液15ml，在50℃加熱10min后，用稱定重量的垂熔坩堝濾過(guò)，濾渣用上述混合液分5 次洗滌，每次10ml ，在105 ℃干燥至恒重，遺留殘?jiān)坏眠^(guò)2mg。,垂熔坩堝,垂熔坩堝也叫砂芯坩堝，是一種坩堝式濾器，用玻璃粉壓制成

10、砂芯濾板，適用與定量分析對(duì)實(shí)驗(yàn)物可作過(guò)濾，干燥，稱量的聯(lián)合操作。造型為一只上口大下口小無(wú)底的錐形杯，在杯內(nèi)的下截部位焊有一片砂芯片，或稱為濾片，代替濾紙作過(guò)濾溶液用，濾片孔徑有粗細(xì)之分，1 號(hào)最粗，6 號(hào)最細(xì)，除砂芯濾片粗細(xì)區(qū)分之外，還有容量大小之分。由于它的底是平的，適合對(duì)過(guò)濾后滯留在砂芯片上的殘?jiān)苯右坪嫦鋬?nèi)干燥，稱量時(shí)也可直接放入天平上稱量。,3、其它金雞納堿原理：吸附性質(zhì)的差異方法： TLC 或HPLC 主成分

11、自身對(duì)照法或?qū)φ掌穼?duì)照法 規(guī)定限度為0.5%,（二）磷酸咯萘啶的純度檢查 磷酸咯萘啶溶解性：水中溶解、乙醇或乙醚中幾乎不溶 1、酸度目的：檢查控制藥物中的酸性物質(zhì)，主要為成鹽過(guò)程中引入。如pH小于2.4，刺激性較大 方法： 用酸度計(jì)測(cè)定， pH應(yīng)大于2.4,2、水中不溶物原理：加水溶解后，稍放置有黃色不溶物產(chǎn)生方法：取供試品加水溶解，放置30分鐘，過(guò)濾、洗滌、干燥，精密稱定遺留殘?jiān)闹亓俊?注射用藥

12、：殘?jiān)坏贸^(guò)4mg 口服用藥：殘?jiān)坏贸^(guò)7mg,3、氯化物 目的：檢查生產(chǎn)工藝中帶入的氯化物 方法： 磷酸咯萘啶溶液 咯萘啶,加堿,,,,過(guò)濾,濾液，依法檢查,與3.0mL標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉制成的對(duì)照液比較，不得更濃,4、甲醛 來(lái)源：甲醛具有毒性，反應(yīng)中使用甲醛進(jìn)行縮合，對(duì)產(chǎn)品中殘留的甲醛進(jìn)行檢查 方法：對(duì)照液比色法5、四氫吡咯 來(lái)源：四氫吡咯具有毒性，反應(yīng)中使用四氫吡咯進(jìn)行縮合，對(duì)產(chǎn)品中殘留

13、的四氫吡咯進(jìn)行檢查 方法：取本品，加水溶解，加5%碳酸鈉溶液，攪拌、濾過(guò)、濾液加新制的亞硝基鐵氫化鈉乙醛，搖勻、5分鐘內(nèi)不得顯藍(lán)色,四、含量測(cè)定,非水溶液滴定法,CHP,USP,HPLC法,（一）硫酸奎寧的含量測(cè)定 硫酸為二元酸，水溶液中二級(jí)電離，但在非水介質(zhì)中只顯示一元酸，解離為HSO4－。含量測(cè)定時(shí)根據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)判斷化學(xué)計(jì)量摩爾關(guān)系 結(jié)構(gòu)中 喹核堿的堿性較強(qiáng)，可以與硫酸成鹽 喹

14、啉環(huán)的堿性極弱，保持游離狀態(tài) 非水溶液中喹核堿及喹啉環(huán)的N相對(duì)堿性較強(qiáng)，可與強(qiáng)酸成鹽,,,非水溶液滴定法,當(dāng)HA酸性較強(qiáng)時(shí)，反應(yīng)不能定量完成，必須除去或降低HA的酸性，使反應(yīng)順利地完成。,,游離堿類鹽,,被置換出的弱酸,,含量測(cè)定,硫酸奎寧測(cè)定,1摩爾的硫酸奎寧可消耗3摩爾的高氯酸。,（QH+）2·SO42-+3HCLO4→QH22+·HSO4-·CLO4- ＋QH22+·2CLO4-,

15、硫酸奎寧片的含量測(cè)定 考慮到片劑中共存物的干擾（也需消耗高氯酸滴定液）， 把硫酸奎寧片粉經(jīng)強(qiáng)堿溶液堿化，生成奎寧游離堿，用氯仿提取后，再與高氯酸反應(yīng): (QH+)2·SO42+ + 2NaOH → 2Q + Na2SO4 + 2H2O 2Q + 4HCLO4 →2[(QH22+)·(CLO4-)2]因此，1摩爾的硫酸奎寧可消耗4摩爾的高氯酸。,硫酸奎寧片的含量測(cè)定,,硫酸奎寧片的含量測(cè)定,USP,

16、HPLC法,,,甲磺酸的作用?,醋酸的作用?,硫酸奎寧片的含量測(cè)定,離子對(duì)色譜法 ★　　 (1) 定義　離子對(duì)色譜法是把離子對(duì)試劑加入極性流動(dòng)相中，被分析的樣品離子在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑的反離子生成不帶荷電的中性離子對(duì)，從而增加了樣品離子在非極性固定相中的溶解度，使分配系數(shù)增加，改善分離效果?！　?2) 常用離子對(duì)試劑　分析堿類用烷基磺酸鹽為離子對(duì)試劑,如正己烷磺酸鈉。分析酸類常用四丁基季銨鹽，如四丁基胺磷酸鹽。,

17、,(3) 特點(diǎn)　用于有機(jī)酸、堿、鹽的分離，而且可以避免用普通的HPLC儀器長(zhǎng)期進(jìn)行離子色譜時(shí)，流動(dòng)相（酸、堿）對(duì)泵與流路的腐蝕。這種方法在藥物分析中應(yīng)用很廣，如生物堿、有機(jī)酸、磺胺類藥物、某些抗生素與維生素等。在體內(nèi)藥物分析上也有許多應(yīng)用，如在測(cè)定人體內(nèi)堿性藥物的血藥濃度時(shí)，有利于與其代謝產(chǎn)物和內(nèi)源性酸性雜質(zhì)分離。但試劑的價(jià)格較貴是其缺點(diǎn)。,,影響條件：流動(dòng)相一般呈酸性，以利于生物堿的離解；離子對(duì)試劑的非極性部分越大，形成的離子對(duì)分配

18、系數(shù)越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)（十二烷基磺酸鈉＞庚烷磺酸鈉＞戊烷磺酸鈉）。,第二節(jié) 青蒿素類藥物的分析 青蒿素，又名黃蒿素，是從菊科植物黃花蒿中提取分離得到的一個(gè)含過(guò)氧基團(tuán)的新型倍半萜內(nèi)酯。 該品為一高效、速效抗瘧藥。作用于瘧原蟲紅細(xì)胞內(nèi)期，適用于間日瘧及惡性瘧，特別是搶救腦型瘧均有良效。其退熱時(shí)間及瘧原蟲轉(zhuǎn)陰時(shí)間都較氯喹短。對(duì)氯喹有抗藥性的瘧原蟲，使用該品亦有效。 蒿甲醚：是青蒿素的脂溶性衍生物 青

19、蒿琥酯 ：是青蒿素的水溶性衍生物 雙氫青蒿素：是青蒿素經(jīng)還原制得，同時(shí)也是青蒿琥的體內(nèi)活性代謝物酯,中國(guó)抗瘧新藥的研究源于1967年成立的五二三項(xiàng)目，其全稱為中國(guó)瘧疾研究協(xié)作項(xiàng)目，成立于1967年的5月23日,因絕密軍事項(xiàng)目,遂設(shè)代號(hào)523。,發(fā)展,歷經(jīng)380多次鼠瘧篩選，1971年10月取得中藥青蒿素篩選的成功。1972年從中藥青蒿中分離得到抗瘧有效單體，命名為青蒿素，對(duì)鼠瘧、猴瘧的原蟲抑制率達(dá)到100%。,1973年經(jīng)臨床研

20、究取得與實(shí)驗(yàn)室一致的結(jié)果、抗瘧新藥青蒿素由此誕生。,1981年10月在北京召開(kāi)的由世界衛(wèi)生組織主辦的“青蒿素”國(guó)際會(huì)議上，中國(guó)《青蒿素的化學(xué)研究》的發(fā)言，引起與會(huì)代表極大的興趣，并認(rèn)為“這一新的發(fā)現(xiàn)更重要的意義是在于將為進(jìn)一步設(shè)計(jì)合成新藥指出方向”。,1986年，青蒿素獲得新一類新藥證書，雙氫青蒿素也獲一類新藥證書。這些成果分別獲得國(guó)家發(fā)明獎(jiǎng)和全國(guó)十大科技成就獎(jiǎng)。,2011年9月，中國(guó)女藥學(xué)家屠呦呦因創(chuàng)制新型抗瘧藥———青蒿素和雙氫青蒿

21、素的貢獻(xiàn)，獲得被譽(yù)為諾貝爾獎(jiǎng)“風(fēng)向標(biāo)”的拉斯克獎(jiǎng)。這是中國(guó)生物醫(yī)學(xué)界迄今為止獲得的世界級(jí)最高級(jí)大獎(jiǎng)。,屠呦呦，女，1930年12月30日生，藥學(xué)家，中國(guó)中醫(yī)研究院終身研究員兼首席研究員，青蒿素研究開(kāi)發(fā)中心主任。1980年聘為碩士生導(dǎo)師，2001年聘為博士生導(dǎo)師。多年從事中藥和中西藥結(jié)合研究，突出貢獻(xiàn)是創(chuàng)制新型抗瘧藥———青蒿素和雙氫青蒿素。,填補(bǔ)了華人十年未獲此獎(jiǎng)的空白，也造就了第一位在中國(guó)獨(dú)立完成研究的獲獎(jiǎng)?wù)摺?研究歷史:很遺憾的事情

22、,這個(gè)藥物雖然由我國(guó)發(fā)現(xiàn),但我國(guó)卻沒(méi)有取得專利.因此,雖然這個(gè)藥物每年在全球產(chǎn)生巨大的效益,但我國(guó)還是處于原料供應(yīng)的地位,而這個(gè)地位還受到嚴(yán)重威脅.,遺憾,青蒿素類藥物結(jié)構(gòu)與性質(zhì),青蒿素類藥物結(jié)構(gòu)與性質(zhì),是青蒿素經(jīng)還原制得，同時(shí)也是青蒿琥酯的體內(nèi)活性代謝物質(zhì),青蒿素類藥物結(jié)構(gòu)與性質(zhì),是青蒿素的水溶性衍生物,青蒿素類藥物結(jié)構(gòu)與性質(zhì),是青蒿素的脂溶性衍生物,性質(zhì)：1、具有過(guò)氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有氧化性2、具有旋光性3、水解反應(yīng)

23、： 青蒿素：結(jié)構(gòu)中有內(nèi)酯，在堿性條件下水解 其余藥物結(jié)構(gòu)中沒(méi)有內(nèi)酯，不發(fā)生水解4、紫外吸收 母核中不具有共軛體系，紫外吸收主要為末端吸收，C-10不同的取代基具有一定的吸收特征,青蒿素類藥物的鑒別試驗(yàn),呈色反應(yīng),（1）過(guò)氧橋鍵具有氧化性,酸性條件下能將碘離子氧化成碘與淀粉指示液顯藍(lán)紫色,（2）羥肟酸鐵反應(yīng),含內(nèi)酯的化合物、羧酸衍生物和一些酯類化合物在堿性條件下與羥胺反應(yīng)生成羥肟酸。在稀酸溶液中與高鐵離子呈色,顯紫色,（3

24、）香草醛-硫酸反應(yīng),使分子中的羧基脫水，增加雙鍵位移，分子縮合反應(yīng)生成其軛系統(tǒng)，在酸作用下形成陽(yáng)碳離子鹽而顯色,吸收光譜特征,紅外，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照,紫外，取代基末端吸收以資鑒別,色譜法,HPLC法,保留時(shí)間定性,利用比較供試品溶液主峰的保留時(shí)間（tR)是否一致或比較供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的位置和顏色與對(duì)照品溶液主斑點(diǎn)的位置和顏色是否相同進(jìn)行鑒別。 青蒿素類抗瘧原料藥在ChP2010中均采用HPLC法進(jìn)行鑒別，但部分制劑中也采

25、用TLC進(jìn)行鑒別。 HPLC法一般都規(guī)定在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間一致。,純度檢查： 青蒿素是以天然藥材分離提取為主，藥品中通常存在結(jié)構(gòu)類似的有關(guān)物質(zhì)，可以采用TLC或HPLC進(jìn)行純度檢查含量測(cè)定：,有關(guān)青蒿素含量測(cè)定的方法有紫外分光光度法、薄層掃描法、HPLC等。高效液相色譜法在測(cè)定實(shí)際樣品時(shí)，色譜柱易被污染，并且對(duì)前處理要求嚴(yán)格,分析時(shí)間長(zhǎng)；毛細(xì)管電泳

26、法測(cè)定青蒿素的應(yīng)用較少，且都為紫外吸收檢測(cè)。,1.TLC法,2.HPLC法,采用雜質(zhì)對(duì)照品與供試品溶液自身稀釋對(duì)照并用法,分離效能高、專屬性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏性好，可以準(zhǔn)確的測(cè)定各組分的峰面積。分為外標(biāo)法、加校正因子的主成分自身對(duì)照測(cè)定法、不加校正因子的主成分自身對(duì)照法、面積歸一法。,練習(xí)與思考,1、用溶劑提取后非水溶液滴定法測(cè)定奎寧片的含量時(shí)，1mol的硫酸奎寧可消耗高氯酸的摩爾數(shù)是A、0.5molB、1molC、2molD、3mo

27、lE、4mol,2、非水溶液滴定法測(cè)定硫酸奎寧原料藥的含量時(shí)，1mol的硫酸奎寧可消耗高氯酸的摩爾數(shù)是A、0.5molB、1molC、2molD、3molE、4mol,3、具有綠奎寧反應(yīng)的藥物是A、硫酸奎寧B、鹽酸嗎啡C、磷酸可待因D、鹽酸麻黃堿E、硫酸阿托品,4、ChP2010中用于某生物堿的鑒別方法為：供試品水溶液中滴加溴試液與氨試液，即顯翠綠色，該反應(yīng)是A、綠奎寧反應(yīng)B、甲醛-硫酸試驗(yàn)C、Vitali反