雙氫青蒿素(DHA)抗肝纖維化作用初探.pdf

1、[背景]
　　肝纖維化常繼發(fā)于各種形式的慢性肝損傷，是各種慢性肝病發(fā)展的病理過程，開發(fā)有效的防治肝纖維化的藥物仍是困擾醫(yī)學界的難題。肝纖維化病理過程中的核心環(huán)節(jié)就是肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化，進而大量地分泌細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。ECM的過度沉積會導致肝功能損傷，如無有效治療，最終將有發(fā)展為肝硬化及肝癌的可能。目前還沒有藥物被FDA批準用于抗肝纖維

2、化的治療，新藥的研發(fā)成本較高，時間久，那么從現(xiàn)有的安全性明確且已被廣泛應(yīng)用于臨床治療其他疾病的藥物中挖掘其抗肝纖維化作用是本次研究的出發(fā)點。
　　我國藥學工作者從中藥黃花蒿葉中提取分離得出的一種倍半萜內(nèi)酯類化合物:青蒿素，其化學結(jié)構(gòu)經(jīng)過改造、修飾，先后發(fā)展了青蒿琥酯、蒿甲醚、雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)等多種衍生物。DHA是青蒿素及其衍生物蒿甲醚和青蒿琥酯在體內(nèi)的有效活性代謝產(chǎn)物。最新研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素

3、的衍生物青蒿琥酯具有一定的抗肝纖維化作用，但目前國內(nèi)外未有涉及DHA抗肝纖維化的研究報導?；谝陨系难芯?，考慮到DHA是青蒿素及其衍生物在體內(nèi)的有效活性代謝產(chǎn)物。本論文選擇DHA，并探究其抗肝纖維化的作用及具體的作用機制。
　　[研究方法]
　　本論文主要圍繞體內(nèi)、體外兩部分實驗進行展開。
　　1)體內(nèi)研究部分:本研究采用膽管結(jié)扎(bile duct ligated，BDL)誘導大鼠肝纖維化模型，DHA不同濃度(3.5

4、、7、14mg/kg)及陽性對照藥物秋水仙堿(0.1mg/kg)干預處理，末次給藥24h后，取血清檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、膽紅素(Bilirubin);取肝組織和血清檢測羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)水平;HE染色、馬松染色和天

5、狼猩紅染色檢測肝組織病理切片;免疫熒光及Western blot檢測肝組織中α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、α1(Ⅰ)型前膠原(α1(Ⅰ)Procollagen)、纖連蛋白(Fibronectin)等與HSC活化有關(guān)的指標;同時采用試劑盒檢測透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid,HA)、層黏連蛋白(Laminin，LN)、Ⅲ型前膠原(ProcollagenⅢ，PCⅢ)等肝纖維化指標;利用

6、免疫熒光探究DHA對活化HSC凋亡的影響
　　2)體外研究部分:首先運用MTT法、LDH法以及AST、ALT試劑盒考查DHA體外對人正常LO2肝細胞的影響;通過MTT、LDH法考察不同濃度DHA對HSC的毒性，以選擇對HSC無毒性的DHA劑量作為接下來的用藥濃度;采用Hoechst33258染色、流式細胞術(shù)和Western blot考查DHA對HSC細胞周期和凋亡的影響;最后考察DHA誘導活化HSC凋亡的分子機制。
　　[研

7、究結(jié)果]
　　1、肉眼觀察肝臟，發(fā)現(xiàn)BDL組的肝臟表面顏色發(fā)黃，觸感粗糙，質(zhì)地變硬，且有許多顆粒狀物質(zhì);HE染色結(jié)果顯示，模型組的SD大鼠肝臟組織肝小葉的結(jié)構(gòu)完全被破壞，大量炎性細胞浸潤，纖維增生彌散，給予低(3.5mg/kg)、中(7mg/kg)、高(14mg/kg)劑量組DHA治療后，發(fā)現(xiàn)其肝臟組織結(jié)構(gòu)得到明顯改善;血清生化指標結(jié)果顯示，模型組SD大鼠血清中的ALP、ALT、AST、Bilirubin含量顯著升高，DHA能降低

8、血清中ALP、ALT、AST、Bilirubin水平，并表現(xiàn)出劑量依賴性;ELISA結(jié)果顯示，不同劑量的DHA劑量依賴性地降低大鼠肝臟及血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-6(interleukin-6，IL-6)的升高。這些結(jié)果提示DHA對BDL引起的肝損傷有顯著的保護作用。
　　2、馬松染色、天狼猩紅染色及Hyp含量檢測顯示，BDL誘導肝臟出現(xiàn)大量膠原纖維沉積，組織和血

9、清中的Hyp含量顯著上升，而不同劑量的DHA可明顯地抑制膠原纖維的生成，降低Hyp水平;試劑盒檢測HA、LN、PCⅢ在肝臟及血清中的水平，結(jié)果顯示模型組SD大鼠的纖維指標明顯升高，DHA能夠降低這些因子的表達，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性;免疫熒光染色、Western blot結(jié)果顯示，不同劑量的DHA劑量依賴性地抑制BDL誘導的與HSC活化有關(guān)的指標如α-SMA、α1(Ⅰ)Procollagen、Fibronectin等的升高，表明DHA

10、能通過抑制HSC的活化，發(fā)揮抗肝纖維化的作用;DHA可促進活化HSC表面的Cleaved-Caspase-3的表達，誘導活化HSC的凋亡。
　　3、體外MTT法、LDH法和AST、ALT試劑盒實驗結(jié)果顯示，DHA體外對肝細胞沒有明顯毒性作用;Western blot及免疫熒光實驗結(jié)果顯示，DHA劑量依賴性地抑制HSC的增殖和活化;流式細胞儀分析、Hoechst33258染色、線粒體膜電位試劑盒檢測(JC-1)及Western bl

11、ot檢測顯示，DHA使HSC阻滯在S期，并能誘導HSC發(fā)生線粒體凋亡。
　　4、Western blot結(jié)果顯示藥物DHA誘導HSC凋亡與PI3K/Akt信號通路相關(guān)。通過加入表皮生長因子（epidermal growth factor, EGF）誘導PI3K的磷酸化和PI3K的抑制劑LY294002，明確PI3K/Akt信號通路與DHA誘導HSC凋亡的作用關(guān)系。
　　5、Western blot結(jié)果顯示DHA能抑制纖維化標