rh血型系統(tǒng)及檢測1

1、Rh血型系統(tǒng)及檢測技術(shù),湖南省人民醫(yī)院 歐陽顯楚,概 述,Rh血型在紅細胞血型系統(tǒng)中序列為4，符號為RH。數(shù)字表示為004。ISBT現(xiàn)已確定的Rh血型抗原有46個，其中D、C、E、c、e抗原分別表示為RH1.RH2.RH3.RH4.RH5或004001，004002，004003，004004，004005.人類Rh血型基因位于染色體IP36.13-P34.3上，現(xiàn)已明確Rh血型的雙結(jié)構(gòu)基因（two structure R

2、H genes）擯棄傳統(tǒng)假說，即Fisher-Race的緊密連接的3個基因位點C、D、E基因假說和wienerr Rh-Hr多等位基因位點的單基因假說。由于Fisher-Race CDE命名能夠簡單明了表述Rh血型系統(tǒng)，且在文獻中及日常血型工作中也更為人們所熟悉，故Rh血型CDE表述和ISBT規(guī)范的數(shù)字、字母及6位數(shù)字表同時應(yīng)用，而不再使用Rh-Hr的表達方式。,Rh血型基因,編碼Rh血型抗原為兩個高度同源的基因RHD基因和RHCE基因

3、，RHD編碼D抗原，RHCE編碼Cc/Ee抗原。RHD抗原陽性者的人有RHD和RHCE基因，而RHD陰性的人絕大部分只有RHCE基因無RHD基因，或少部分為RHD陰性者有無功能的RHD基因，因此不存在d抗原，也無抗-d抗體。RHD和RHCE基因均含有10個內(nèi)含子和10個外含子，其兩基因堿基數(shù)量及排列基本是一致的 。,Rh血型抗原,Rh血型基因編碼兩條多肽，即RHD編碼D抗原多肽，RHCE基因編碼CcEe多肽，兩條多肽均為416個氨基酸組

4、成，貫穿紅細胞膜12次，成6個環(huán)，NH2端和COOH端均在細胞漿中。應(yīng)用分子生物學技術(shù)和單克隆抗D試劑研究結(jié)果，擯棄了傳統(tǒng)的DuD variant和Dmosaic等幾種表示弱D抗原的方式?，F(xiàn)將RHD抗原分為5種，分別是：（1）D-正常D抗原（2）弱D(WeakD）-抗原質(zhì)正常而量少的RhD抗原（3）不完全D-抗原(partial D)數(shù)目基本正常，缺少部分D抗原表位，（4）不完全弱D(partial weak D)型抗原數(shù)量少同時缺少抗

5、原決定簇的D抗原（5）增強性D-(elevated D) D抗原在數(shù)量上增加很多，抗原性增強。Rh血型抗原只存在于紅細胞膜中，不存在于其他組織細胞膜、體液和分泌液中。,Rh血型抗體,Rh血型抗體是妊娠、輸血或其他明確原因產(chǎn)生的同種異型免疫抗體。極少見RH血型自然發(fā)生的抗體。自身免疫性溶血性疾病體內(nèi)可發(fā)現(xiàn)Rh自身抗體。人源淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備的RH血型單克隆抗體已被用于臨床常規(guī)血型試劑，也被應(yīng)用于Rh血型抗原表位的研究。,Rh血型功能,

6、Rh血型抗原多肽在紅細胞膜上發(fā)揮結(jié)構(gòu)和功能蛋白的作用，即維持紅細胞膜結(jié)構(gòu)完整性，同時發(fā)揮著陽離子膜轉(zhuǎn)運通道的作用，以及可能發(fā)揮著磷脂酰絲氨酸在細胞膜雙層間運動的催化作用。,歷史和命名,Rh血型發(fā)現(xiàn)和歷史： 1939年Levine 和Stetson發(fā)現(xiàn)一例流產(chǎn)死胎婦女的血清凝集其丈夫紅細胞，也凝集ABO血型相容80%獻血者的紅細胞，實驗表明該紅細胞抗原不同于當時已發(fā)現(xiàn)的人類ABO、MN、和P血型抗原。他們認為是該

7、婦女被胎兒攜帶的源自父親的抗原所免疫，產(chǎn)生的抗體與父親紅細胞反應(yīng)，也是該抗體導致胎兒溶血死亡。1940年Landsteiner和Wiener用恒河猴紅細胞免疫兔（后來用豚鼠），產(chǎn)生的抗體與恒河猴紅細胞反應(yīng)，也凝集85%的白人的紅細胞。同年，Wiener和Peter通過實驗認為Levine和Stetson發(fā)現(xiàn)的血清抗體和其他一些輸用ABO血型相容血液之后，發(fā)生輸血反應(yīng)的病人血清中抗體與抗-Rh是一致的。但兩年后的1942年，F(xiàn)isk和Fo

8、ord確證動物和人抗-Rh是不同的特異性：所有新生兒紅細胞，用人抗-Rh確定的不論是Rh陽性或者Rh陰性，與動物抗-Rh反應(yīng)均為陽性。然而，又經(jīng)過20年時間，證明動物和人抗-Rh識別的是不同抗原。1963年Levine提議將動物抗-Rh識別的抗原命名為LW,以紀念Levine和Wiener的工作?？紤]已發(fā)表的成千上萬篇文章，人們已形成習慣，故將Levine和Stetson發(fā)現(xiàn)的人抗體所識別的抗原仍稱之為Rh抗原。目前已明確Rh和LW是不

9、同的血型系統(tǒng)，Rh系統(tǒng)序列為4，LW序列為16，各具有不同的的抗原，各自編碼基因分別位于染色體第1和19條上，基因已被克隆出來。,,在60年代中期，人們發(fā)現(xiàn)孕婦D抗原陰性，胎兒RhD陽性。在胎兒出生后很短時間內(nèi)母親被注射抗D免疫球蛋白，能夠防止由于RhD血型不相容妊娠所導致的母親被D抗原免疫，有效地預(yù)防胎兒新生兒溶血?。℉DN）。這樣，在Levine和他的同事發(fā)現(xiàn)了HDN的病因并能夠成功地采取預(yù)防措施，這經(jīng)過了1/4世紀左右的時間。,,

10、Rh血型命名 Fisher-Race假說和命名：1943年Fisher使用Race提供的4種Rh血型抗體，發(fā)現(xiàn)其中兩種是對應(yīng)的，識別的是等位基因編碼的抗原稱之為C和c,而另外兩種抗體識別的抗原顯示不是等位基因編碼的稱之為D和E。Fisher設(shè)想它們是緊密連鎖的3個基因編碼；D或d、C或c、E或e抗原，并由此可組成8個不同的基因復(fù)合物或單倍體。之后又出現(xiàn)了抗-e,支持Fisher假說，但始終未發(fā)現(xiàn)-d。目前CDE表達和ISBC規(guī)范的

11、字母/數(shù)字和數(shù)字量表達方式同時使用。Winer假說字母數(shù)字表述：Rosenfield等人1962年提出一種更適合電子計算機語言的字母/數(shù)字方式來表達Rh血型方式。抗D和抗Rh表述為抗Rh1,D+紅細胞為Rh:1,D-為Rh:-1,等位基因表示為R1和R-1。傳統(tǒng)的CDE、Rh-Hr和ISBT規(guī)范的以字母、數(shù)字方式對Rh基因復(fù)合物的表述以及其頻率，見表1,,表1 Rh 基因復(fù)合物三種表述及頻率 基因 復(fù)合物

12、 頻率----------------------------------------------------------------------------------CDE Rh-Hr 字母/數(shù)字 英國 中國(廣東人)-------------------------------------------

13、---------------------------------------DCe R1 Rh1,2,-3,-4,5 0.4205 0.7292dce r Rh-1,-2,-3,4,5 0.3886 0.0232DcE R2 Rh1,-2,3,4,5 0.14

14、11 0.1870Dce R0 Rh1,-2,-3,4,5 0.0257 0.0334dcE r” Rh-1,-2,3,4,-5 0.0119 0.0000dCe r’ Rh-1,2,-3,-4,5 0.0098 0.0189DCE

15、 Rx Rh1,2,3,-4,-5 0.0024 0.0041dCE Ry Rh-1,2,3,-4,-5 0.0000 0.0036,雙結(jié)構(gòu)基因模型,Tippert在1986年提出Rh血型的雙結(jié)構(gòu)模型:一個基因編碼D抗原,另一個編碼CcEe抗原;一些少見的Rh復(fù)合物即Rh抗原不正常表達的原因被認為是基因的突變或兩等位位點

16、不交換等,之后分子生物學研究大量結(jié)果證實了Tippert提出的Rh血型雙結(jié)構(gòu)基因模型(two structural Rh gene models),見圖.,D陽性（RH：1）,D陽性（RH：-1）,圖 RH雙結(jié)構(gòu)基因—Two Structural Rh Geneg,(1986年Tippett提出，cDNA，PCR技術(shù)證實),,1、RH血型抗原由兩個基因編碼，RHD編碼D抗原，RHCE編碼Cc/Ee抗原。2、RHD陽性人有RHD和RH

17、CE基因，RHD陰性人大部份只有RHCE基因無RHD基因，但少部分人有無功能的RHD基因。3、RHD和RHCE基因均為10個外含子和10個內(nèi)含子。4、RHD無等位基因，既無d基因，也必然無d抗原和-d抗體。5、現(xiàn)在已經(jīng)擯棄了RH血型基因兩個假說：（1）Fisher-Races:C,D,E三個緊密連接的基因位點學說。（2）wieners:Rh-Hr單一基因的多等位基因假說。,D抗原,D血型抗原 ISBT表述為RH1或0040

18、01。發(fā)生頻率在高加索人約為85%，黑人為92%，亞洲人和土著美國人99%以上。D抗原只存在于紅細胞膜（包括臍帶血紅細胞）不存在于其它組織細胞中，體液和分泌液中也無D抗原。D抗原的表述有量的變化和質(zhì)的變化。 D抗原量的變化表現(xiàn)其抗原性的強弱。表型D/D抗原量最多，抗原性最強，而弱D抗原量少，最弱的抗原是Del，要通過試驗確定Del抗原性。每個紅細胞D抗原數(shù)為普通D表型1.0×104～3.3×104，弱D表型2.0

19、×102～1.0×104，增強型D表型7.5×104～4.5×104。在C抗原存在時，D抗原性減弱DcE/DcE紅細胞的D抗原性強于DCe/DCe紅細胞。對一些常見的紅細胞的D抗原強度序列大致是：DcE/DcE＞DCe/DCe＞DcE/dce（見正文），D抗原的質(zhì)變主要是指D抗原表位數(shù)目減少。RH基因變異導致D抗原表位部分缺失，大多數(shù)表現(xiàn)為抗原性減弱，但部分抗原性正常增強。該類紅細胞稱之D抗原性表

20、位不完全型紅細胞（Partial D red Cells）。D抗原性表位不完全紅細胞也為D陽性，但是有D表位不完全型紅細胞的人可能由輸血后妊娠產(chǎn)生針對其紅細胞缺失的抗原表位的抗體。,,D抗原分類：根據(jù)D抗原的數(shù)量和質(zhì)量不同以及抗原性不同，將D抗原分類為5種。（1）D：常見的D抗原。（2）弱D：只是D抗原量少，質(zhì)無變化，現(xiàn)稱之為DU，不同于傳統(tǒng)的DU，傳統(tǒng)的DU包括D抗原量減少和質(zhì)量變化的紅細胞。（3）表位不完全型D（Partial

21、 D）D抗原數(shù)數(shù)目基本正常，但缺失正常D抗原上部分抗原表位。（4）表位不完全型弱D：缺失部分D抗原決定簇同時D抗原數(shù)目也減少。（5）增強D：D抗原數(shù)數(shù)量增多，抗原性大大加強。,D抗原與臨床,D抗原、抗體與輸血的關(guān)系僅次于ABO血型，RhD陰性人接受陽性血后，至少20%要對D抗原發(fā)生致敏，在第二次體內(nèi)接觸（再次輸注Rh陽性血）該抗原則會發(fā)生溶血反應(yīng)。RhD陰性妊娠婦女的胎兒是陽性時，可能胎兒紅細胞通過胎盤進入母體，RhD抗原致敏母體，

22、該婦女再妊娠時，就可能發(fā)生新生生溶血病。ABO-HDN將近—半發(fā)生于第一胎。Rh-HDN的第一胎往往不發(fā)病，除非母親曾接受過Rh陽性血或第一胎是Rh陽性而且母親已產(chǎn)生了對抗以后嬰兒紅細胞的抗體。西方國家妊婦Rh-HDN約占全部新生兒1/180。ABO-HDN發(fā)病率約為1/40，但癥狀比Rh-HDN較輕。衛(wèi)生部制定的《臨床輸血技術(shù)規(guī)范》規(guī)定，從2000年10月1日起，每個病人均要檢查Rh(D)血型，這是確保臨床輸血安全有效的又一項重

23、要舉措。各單位要認真落實《規(guī)范》精神。采供血機構(gòu)也要適應(yīng)這一新形勢，開展Rh血型檢測及HDN的有關(guān)實驗室檢查，確保病人的安全。,RH血型檢測,一、血清克隆抗D檢測D抗原原理：由細胞培養(yǎng)而得的lgM人類免疫球蛋白單克隆抗體，適合于玻片法和試管法，用來鑒定人Rh血型系統(tǒng)中的D抗原。操作步驟（試管法）：1、用等滲鹽水配制3%～5%待檢紅細胞懸液。2、在相應(yīng)標記的試管中加一滴血清克隆抗D試劑和一滴紅細胞懸液。3、1000rpm(150

24、×g)離心2分鐘或3000rpm（1000×g）離心20秒。4、輕輕振蕩，懸浮沉積細胞，觀察凝集結(jié)果。5、若反應(yīng)為陰性、弱陽性或可疑，20攝氏度孵育15分鐘。6、1000rpm（150×g）離心2分鐘或3000rpm（1000×g）離心20秒。7、輕輕振蕩，懸浮沉積細胞，觀察凝集結(jié)果。,,二、用五種抗血清檢查Rh血型1、初篩實驗結(jié)果為Rh(D)陰性，可進一步用抗C、抗c、抗D、抗E、抗e

25、檢測受檢查Rh血型18種表現(xiàn)型。2、如初篩結(jié)果Rh(D)陰性，最好送血型參比實驗室做進一步確證試驗。3、用五種抗血清檢查Rh血型結(jié)果判定。,,用五種抗Rh血清檢查結(jié)果判定與各種抗血清的反應(yīng) 受檢者 字母/數(shù)字表示 抗C c D E e Rh表型 + + + + + CcDEe Rh 1.2.3.4.5 + - + - +

26、 CCDee Rh 1.2.-3-4.5 + + + - + CcDee Rh 1.2.-3.4.5 + - + + - CCDEE Rh 1.2.3-4.-5 - + + + - CcDEE Rh 1.-2-3.4.5 - + + - + ccDee

27、 Rh 1.-2.-3.4.5 - + + + + ccDEe Rh 1.-2.3.4.5 + - + + + CCDEe Rh 1.2.3.-4.5 + + + + - CcDEE Rh 1.2.3.4.-5 + - - - + CCdee Rh

28、 -1.2.-3.-4.5 - + - + - ccdEE Rh -1.-2.3.4.-5 + + - + + CcdEe Rh -1.-2.3.4.5 + + - - + Ccdee Rh -1.2.-3.4.5 - + - + + ccdEe