蘇云金芽胞桿菌自溶素蛋白用于構(gòu)建表面展示系統(tǒng)的研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）是目前應(yīng)用最為廣泛的一類殺蟲細(xì)菌，也是一種具有較高應(yīng)用潛力的細(xì)菌表面展示系統(tǒng)的宿主菌。本研究利用一種推斷的蘇云金芽胞桿菌自溶素蛋白mbG作為運(yùn)載蛋白，成功構(gòu)建了該菌營養(yǎng)生長期細(xì)胞的表面展示系統(tǒng)，進(jìn)一步優(yōu)化分析了運(yùn)載蛋白mbG的展示性能，并用于展示幾種具有不同功能和性質(zhì)的外源蛋白，可為進(jìn)一步發(fā)展蘇云金芽胞桿菌多功能工程菌提供研究基礎(chǔ)。
　　 分析已測序的蘇云金芽胞桿菌菌

2、株的基因組序列，顯示含有多種推斷的細(xì)胞壁錨定相關(guān)蛋白，具有用作構(gòu)建表面展示體系的運(yùn)載蛋白的可能性。據(jù)此設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，從蘇云金芽胞桿菌野生型菌株YBT-1520基因組中克隆到3個與細(xì)胞壁錨定相關(guān)蛋白的編碼基因，分別命名為mbA、mbG和mbP。采用流式細(xì)胞技術(shù)對其編碼蛋白的表面展示性能進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示在自身啟動子的控制下，mbG具有最大的表面展示效率，為47.5％。對其氨基酸結(jié)構(gòu)分析表明，mbG并沒有明顯的分泌信號肽序列和跨膜信

3、號序列，表現(xiàn)出一定的特異性。因此，本研究選取mbG作為研究的主要對象。
　　 進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明mbG為一種推斷的內(nèi)切-β-N乙酰葡萄糖胺酶，由兩個結(jié)構(gòu)域組成，即由兩個串聯(lián)重復(fù)的LysM單元組成的具有細(xì)胞壁錨定活性的N端結(jié)構(gòu)域，和具有催化活性的C端結(jié)構(gòu)域。采用綠色熒光蛋白（GFP）作為標(biāo)簽蛋白構(gòu)建融合表達(dá)體系。Western blot分析、流式細(xì)胞儀分析、蛋白酶降解實(shí)驗、SDS敏感性實(shí)驗、免疫熒光顯微鏡觀察和免疫電鏡觀察證

4、實(shí)了mbG-GFP在表面的定位，同時表明該融合蛋白表達(dá)和展示效率較低。
　　 克隆了不依賴芽胞的cry3Aα的啟動子替換mbG本身啟動子，提高了表達(dá)和表面展示能力。分別克隆了mbG的不同結(jié)構(gòu)單元，N端結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域、LysM1和LysM2，考察它們的細(xì)胞壁結(jié)合能力。mbG的N端結(jié)構(gòu)域為細(xì)胞壁結(jié)合的功能單元，LysM1是主要的錨定單元。進(jìn)一步研究表明，2個N端重復(fù)的錨定單元具有最大的表面展示能力，而3個N端重復(fù)的錨定單元的表面

5、展示能力下降，表明融合蛋白的大小是限制轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因素。
　　 從痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae）W202中克隆了一個推斷的漆酶基因wlac，并且在大腸桿菌（Escherichia coli）中實(shí)現(xiàn)了可溶性的大量融合表達(dá)。純化的漆酶Wlac是一個與大腸桿菌CueO相似的漆酶，分子量為55 kDa，以ABTS為底物測定Wlac的最大酶活為24.4 U/mg（Km=0.086），最佳pH值為2.5。在0℃到25

6、℃內(nèi)穩(wěn)定，大于40℃時活性迅速下降。Wlac能被200 mmol的EDTA完全抑制，32 mmol的SDS、50 mmol的NaN3和60 mmol的三氯乙酸部分抑制。加入Cu2+使得酶活增加，而其它的金屬離子僅具有微弱或者負(fù)效應(yīng)。通過用Phe106替換Glu106得到了突變的漆酶WlacS，刪除一個從Leu 351到Gly 378的α-螺旋得到WlacD，活性分別是Wlac的2.2倍（52.9 U/mg）和3.5倍（85.1 U/mg

7、），另外，WlacD還具有較高的熱穩(wěn)定性。同時還發(fā)現(xiàn)，與內(nèi)含肽融合的漆酶能夠大約維持純酶活性的80％。
　　 以具最有運(yùn)載性能的2個mbG的N端重復(fù)結(jié)構(gòu)單元為錨定模體（anchoring motif），將突變的漆酶’WlacD成功的表面展示到蘇云金芽胞桿菌受體菌BMB171細(xì)胞表面。通過用純化的漆酶制備抗血清，Western blot分析證實(shí)了WlacD的表面定位，全細(xì)胞酶活測定顯示工程菌的酶活達(dá)到15.3 U/mL，該工程菌有