細(xì)胞型朊蛋白受體或結(jié)合蛋白在不同發(fā)育階段小鼠腦內(nèi)的分布

1、<p>　　細(xì)胞型朊蛋白受體或結(jié)合蛋白在不同發(fā)育階段小鼠腦內(nèi)的分布</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞型朊蛋白 </p><p>　　關(guān)鍵詞: 細(xì)胞型朊蛋白;受體;免疫組織化學(xué) </p><p>　　摘 要:目的 表達(dá)和純化以朊蛋白（PrP）胞外部分與人IgG Fc段構(gòu)建的融合蛋白PrPFc，并以此為配體蛋白，定位細(xì)胞型朊蛋白（PrPc）的受體在小

2、鼠不同發(fā)育階段腦內(nèi)的分布. 方法 收集表達(dá)PrPFc的細(xì)胞培養(yǎng)液，通過蛋白A-瓊脂糖柱親和層析純化，以PrPFc純化蛋白與新鮮弱固定的組織切片反應(yīng)，免疫組織化學(xué)法顯示受體在腦內(nèi)分布模式. 結(jié)果 在正常成年小鼠腦內(nèi)，細(xì)胞型朊蛋白的受體分布以位于大腦皮層（包括新皮層和舊皮層）和紋狀體為最多，其次為丘腦、下丘腦及腦干，再次為海馬的CA區(qū)和齒狀回及小腦的蒲肯野和顆粒細(xì)胞層，嗅球部位也有一些細(xì)胞呈陽性染色;出生后14d小鼠腦內(nèi)朊蛋白受體與成年

3、動物分布模式及染色強(qiáng)度皆類似，而出生當(dāng)日及7d后受體分布與14d和成年動物相似，但染色強(qiáng)度明顯較弱. 結(jié)論 朊蛋白受體（或結(jié)合蛋白）在腦組織有廣泛分布;朊蛋白與其受體在腦組織中分布相似. </p><p>　　Keywords:cellular prion protein;receptor;immunohis-tochemistry </p><p>　　Abstract:AIM To

4、recombinant protein PrPFc containing the extracellular portion of prion protein and human IgG Fc fragment was expressed and purified.This fusion protein was used as a ligand to localize the binding proteins for cellular

5、prion protein in adult mouse brains.Distribution pattern of the binding proteins from different developmental stages of mice were detected and compared.METHODS PrPFc was　secreted into the culture medium and purified thro

6、ugh protein A-Sepharose column.The concentra</p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　在細(xì)胞型朊蛋白（cellular prion protein，PrPc）在腦中含量豐富，分布廣泛［1］ .而PrPc受體分子的鑒定也是研究的熱點(diǎn)［2］ .但目前尚未有關(guān)于朊蛋白受體分布的報道.我們制備并純化重組

7、融合蛋白PrPFc作為配體與新鮮弱固定的組織切片上的受體蛋白結(jié)合，定位受體或結(jié)合蛋白在正常小鼠腦區(qū)的分布，并比較受體在小鼠不同發(fā)育階段腦區(qū)分布的異同. </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 材料 表達(dá)PrPFc的CHO細(xì)胞（德國漢堡大學(xué)陳素珍博士提供），蛋白A-瓊脂糖柱（Pharmacia），蛋白濃度測定BCA試劑（P

8、ierce，USA），蛋白酶K（Sigma），冰凍切片機(jī)（Leica），兔抗Fc（Dianova），羊抗兔IgG（Vector），ABC混合試劑（Vector），C57BL/6J野生型小鼠（德國漢堡大學(xué)提供）. </p><p>　　1.2 方法 復(fù)蘇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的表達(dá)分泌型PrPFc的CHO細(xì)胞，收集2～4L細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)蛋白A-瓊脂糖柱親和層析富集純化，蛋白經(jīng)由柱子洗脫后濃縮和濃度測定，取蛋白樣品兩組，其中一組

9、經(jīng)蛋白酶K處理，另一組不做處理，經(jīng)變性SDS-PAGE和Western blot分析.選用C57BL/6J野生型小鼠，年齡段為妊娠15d，出生0，7，14d，6wk，每組各取6只.妊娠15d，出生0，7d動物以斷頭法處死，出生14d和6wk動物以拉頸法處死，迅速取腦，置于已盛有組織保護(hù)液的容器內(nèi)，然后連同容器放入液氮中迅速冷卻，冰凍切片機(jī)冠狀切片，厚度10μm，貼片于以明膠預(yù)包裹的載片.切片室溫干燥2h，繼以40g L-1 多聚甲醛室溫

10、固定20min，PBS洗后以PBS配的10g L-1 BSA室溫封閉1h，將切片分組，以相同摩爾濃度的PrPFc和Fc片段孵育，4℃過夜.次日取出切片以PBS洗滌，然后以兔抗Fc（1 100，Dianova）室溫孵育2h，PBS洗后再經(jīng)生物素化的羊抗兔IgG（1 100，Vector）室溫孵育2h，繼以ABC混合試劑（1 100，Vector）室溫2h，PBS充分洗片后，DA</p><p>　　圖1 － 圖4

11、略 </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　純化PrPFc的SDS-PAGE和以抗PrP和抗Fc為抗體的Western blot表明，所得蛋白為PrPFc，且純度較高.蛋白酶K處理組相應(yīng)的蛋白條帶消失.為排除組織染色由PrPFc中的Fc段引起的假陽性反應(yīng)，以Fc段作為對照，以相同摩爾濃度與相鄰切片反應(yīng).由實驗結(jié)果看，F(xiàn)c在某些部位有弱染色

12、反應(yīng)，在分析陽性染色時予以減除.朊蛋白在腦內(nèi)的受體分布很廣泛，從大的腦區(qū)分布看，大腦皮層（Fig1A），（包括新皮層和舊皮層）以及紋狀體分布最多，陽性細(xì)胞密度高，大腦皮層從內(nèi)層向外層有逐漸增多趨勢.其次丘腦、下丘腦以及腦干陽性染色分布也較均勻，僅陽性細(xì)胞密度較大腦皮層和紋狀體略低.</p><p>　　海馬和小腦的陽性細(xì)胞分布很有特點(diǎn)，海馬的CA區(qū)和齒狀回區(qū)染色密集（Fig2A），海馬結(jié)構(gòu)的其他區(qū)域則僅有稀疏陽性

13、細(xì)胞分布.小腦則以蒲肯野細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層呈特征陽性染色，尤以蒲肯野細(xì)胞層陽性染色更強(qiáng)（Fig3A）.這些腦區(qū)的Fc對照染色僅有弱陽性染色（Fig1B，2B，3B）.嗅球部位也有中等數(shù)目的細(xì)胞染色，并且在高放大倍數(shù)下可見大部分染色位于胞膜和突起（Fig4A，4B，4C）.出生后14d的小鼠朊蛋白的受體分布和成年動物接近，無論在染色的分布區(qū)域和染色強(qiáng)度上都很相似.出生當(dāng)日和生后7d小鼠腦的染色和14d組接近，但同時Fc組的染色也較14d組

14、和成年組的Fc對照強(qiáng).因此，綜合來看，這兩組的陽性染色強(qiáng)度較14d組和成年組弱，陽性染色的腦區(qū)分布無明顯區(qū)別.妊娠15d組切片在反應(yīng)過程中有局部脫落未納入比較分析. </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　朊蛋白有兩種形式，一種為正常的細(xì)胞型朊蛋白（PrPc），另一種為致病型朊蛋白（PrPsc），兩種形式一級結(jié)構(gòu)相同，僅構(gòu)象稍有不同.但P

15、rPc經(jīng)蛋白酶K處理后發(fā)生降解，而PrPsc則抗蛋白酶處理.我們純化的蛋白為PrPc，而結(jié)合實驗所得到的結(jié)果就是PrPc的受體分布.大腦皮層和紋狀體有最豐富的結(jié) 合蛋白成分，其次為丘腦、下丘腦和腦干區(qū)，而在海馬和小腦呈特征分布，即分布集中于海馬的CA區(qū)和齒狀回區(qū)以及小腦的蒲肯野和顆粒細(xì)胞層.皮層、海馬、紋狀體和嗅球有最豐富的PrPc，其次為中腦和丘腦和小腦，再次為腦干［1］ .這個分布特點(diǎn)和受體的分布規(guī)律很相近，提示這些腦區(qū)有可能是朊蛋

16、白和受體相互作用并發(fā)揮功能的部位.需重點(diǎn)提及的是受體在小腦的蒲肯野細(xì)胞層的特征性分布的意義，有報道在對一系朊蛋白基因敲除小鼠（Ngsk）的行為觀察中，這些小鼠出生后成長正常，但在生后70wk時所有的小鼠都出現(xiàn)進(jìn)行性共濟(jì)失調(diào)癥狀.經(jīng)解剖，這些動物的小腦由于廣泛的蒲肯野細(xì)胞死亡而出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮［3］ .受體分布豐富的腦區(qū)可用作受體分離材料并進(jìn)行更進(jìn)一步的鑒定和功能研究. </p><p>　　致 謝 德國漢堡大學(xué)Me

17、litta Schachner教授的支持. </p><p><b>　　參考文獻(xiàn): </b></p><p>　?。?］Liu T，Zwingman T，Li R，Pan T，Wong BS，Peterson RB，Gambetti P，Herrup K，Sy MS.Differential expression of cellu-lar prion protei

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