造血與淋巴組織腫瘤患者紅細(xì)胞的天然免疫黏附功能及對(duì)nk細(xì)胞殺傷活性的影響

1、<p>　　造血與淋巴組織腫瘤患者紅細(xì)胞的天然免疫黏附功能及對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響</p><p>　　作者：張乃紅， 馮玫， 鹿育晉 朱鐳， 劉潔， 高鴻鵬， 李為民， 喬振華</p><p>　　【摘要】 本研究探討造血與淋巴組織腫瘤患者紅細(xì)胞天然免疫黏附功能及紅細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響。外周血枸櫞酸鈉抗凝，檢測(cè)紅細(xì)胞在自身血漿條件下對(duì)K562細(xì)胞的免疫黏附并計(jì)算黏附

2、率。用MTT法測(cè)定紅細(xì)胞對(duì)正常NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞活性的影響，并與未加紅細(xì)胞時(shí)進(jìn)行比較。結(jié)果表明：紅細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞形成了"玫瑰花"樣結(jié)合。正常人紅細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的免疫黏附結(jié)合率為（15.3±6.4）%，造血與淋巴組織腫瘤患者紅細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的免疫黏附結(jié)合率為（7.6±7.0）%，與正常人相比較顯著下降（t=3.61, p﹤0.001）。不加紅細(xì)胞條件下，正常人外周靜脈血NK細(xì)胞殺傷

3、K562細(xì)胞活性為67%-71%。正常人紅細(xì)胞明顯增加NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞活性殺傷率為（14.7±5.2）%，造血與淋巴組織腫瘤患者的紅細(xì)胞減低NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞活性，殺傷率為（4.3±7.6）%，二者比較有顯著差異（t=6.73， p﹤0.0001）。結(jié)論：造血與淋巴組織腫瘤患者紅細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的免疫黏附能力下降，正常人紅細(xì)胞明顯增加NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞活性，而造血與淋巴組織腫瘤患者的紅細(xì)胞減低N

4、</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 造血組織腫瘤</p><p>　　Erythrocyte Native Immune Adhering Function (ENIAF) in Patients with Hematopoietic and Lymphoid Neoplasms and Its Effect on NK Cell Killing Activity</p>

5、;<p>　　Abstract The objective of this study was to investigate the change of native immune adhering function (ENIAF) in selfplasma of patients with hematologic and lymphoid neoplasms and its effect on the

6、 killing activity of NK cells. The whole blood was anticoagulated with citric acid. 5 μl precipitated red blood cells and 500 μl plasma of patients or controls were directly mixed with 750 μl quantitative K562 cells at

7、37℃ for 30 minutes. One K562 cell attached by one or more erythrocytes was</p><p>　　Key words hematopoietic neoplasm; lymphoid neoplasms; erythrocyte; innate immune adhering function; NK cell</p>

8、<p>　　紅細(xì)胞作為天然免疫的一個(gè)重要的構(gòu)成部分，是機(jī)體免疫平衡和穩(wěn)定的重要基礎(chǔ)［1］。紅細(xì)胞能夠結(jié)合、固定、聚集免疫復(fù)合物或微生物，將其呈遞給吞噬細(xì)胞［2，3］，使吞噬細(xì)胞的吞噬作用增強(qiáng)4-6倍。紅細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠增強(qiáng)T細(xì)胞依賴(lài)的免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)B細(xì)胞的活化及Ig的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)補(bǔ)體的活化過(guò)程，還能促進(jìn)NK細(xì)胞的殺傷作用。研究表明，NK細(xì)胞直接介入控制AML的復(fù)發(fā)；把NK細(xì)胞植入NOD/SCID小鼠排斥了植入的AML細(xì)

9、胞，這也證明NK細(xì)胞對(duì)移植的AML有異體反應(yīng)性。紅細(xì)胞的NK細(xì)胞增強(qiáng)因子（natural killer cell enhancing factor， NKEF）是抗氧化劑家族的重要成員，它存在于紅細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，能夠顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)K562殺傷活性。</p><p>　　造血與淋巴組織腫瘤患者紅細(xì)胞的天然免疫黏附功能及對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響王海濱等［4］建立了紅細(xì)胞天然免疫黏附功能的快速檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)單、重

10、復(fù)性高和穩(wěn)定性好。我們應(yīng)用此方法研究了造血和淋巴組織腫瘤患者紅細(xì)胞對(duì)K562 細(xì)胞的天然免疫黏附功能，用MTT法測(cè)定了造血與淋巴組織腫瘤患者紅細(xì)胞對(duì)正常人來(lái)源的NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞活性的影響。</p><p><b>　　材料和方法</b></p><p><b>　　病例來(lái)源</b></p><p>　　造血與淋巴組

11、織腫瘤患者來(lái)源于山西省人民醫(yī)院或山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科門(mén)診及住院患者，正常對(duì)照者為門(mén)診體檢的健康人，年齡、性別構(gòu)成一致，具有可比性。患者24例，男性15例，女性9例，年齡19-57歲，其中CML 3例，AML 10例（M3 6例，M4 2例，M5 2例），MDS 1例，ALL 7例，MM 2例，NHL1例。正常對(duì)照21例，男性13例，女性8例，年齡18-48歲?；颊哐獦?biāo)本采集時(shí)間為初診或化療3周以后，以避免藥物對(duì)檢測(cè)結(jié)果

12、的影響。</p><p><b>　　主要儀器</b></p><p>　　CO2培養(yǎng)箱（Heraeus and LISHEN公司生產(chǎn)），培養(yǎng)瓶（50 ml），超凈工作臺(tái)，自動(dòng)雙重純水蒸餾器（蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng)生產(chǎn)），高速離心機(jī)(centrifuge 5810R型)，水浴鍋，可調(diào)微量加樣器、微量滴頭，普通、倒置顯微鏡（Olympas），骨髓圖象分析儀(天津），細(xì)胞記數(shù)板，

13、40孔酶標(biāo)板，流式細(xì)胞儀（Conlter公司產(chǎn)品），酶標(biāo)儀分光光度計(jì)（北京六一儀器產(chǎn)品）。</p><p><b>　　主要試劑</b></p><p>　　1640培養(yǎng)基購(gòu)自晶美公司，10%胎牛血清，戊二醛，姬姆薩染液。淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll液），磷酸緩沖液（PBS）， MTT粉末、DMSO購(gòu)自晶美公司。</p><p><b&g

14、t;　　K562細(xì)胞培養(yǎng)</b></p><p>　　K562細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（上海），放于1640培養(yǎng)液中、在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。于倒置顯微鏡下觀(guān)察K562細(xì)胞生長(zhǎng)情況。根據(jù)細(xì)胞密度每36-48小時(shí)半量換液次。</p><p>　　紅細(xì)胞天然免疫黏附功能檢測(cè)</p><p>　　由肘靜脈取全血2 ml，枸櫞酸鈉抗凝， 1 500 r

15、pm離心5分鐘。取500 μl病人血漿和5 μl沉淀的紅細(xì)胞，直接加到750 μl新鮮配制的定量靶細(xì)胞K562 細(xì)胞（濃度為105/ml）懸液中，混勻。37℃，水浴30 分鐘。加1 ml固定緩沖液(0.25 %戊二醛)，輕輕混勻，5分鐘后閱片。閱片要求：取混勻液150 μl加50 μl姬姆薩氏染液，懸浮涂片(玻片的2 /3)。取4個(gè)角和中心5區(qū)閱片，每區(qū)閱讀20個(gè)靶細(xì)胞，結(jié)合上紅細(xì)胞（1個(gè)以上）的靶細(xì)胞為1個(gè)結(jié)合單位，計(jì)數(shù)100個(gè)靶細(xì)

16、胞，計(jì)算黏附率（每例標(biāo)本重復(fù)2次，結(jié)果取平均值）：</p><p>　　紅細(xì)胞黏附率(%) = ［黏附1個(gè)以上紅細(xì)胞的靶細(xì)胞數(shù) / 5區(qū)閱讀的共100個(gè)靶細(xì)胞］×100%</p><p>　　按常規(guī)方法分離效應(yīng)細(xì)胞（外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMNC），流式細(xì)胞儀檢測(cè)其CD3-（CD16CD56）+ 細(xì)胞即NK細(xì)胞的表達(dá)（由流式細(xì)胞儀直接給出PBMNC中NK細(xì)胞的百分率）。</p&

17、gt;<p>　　殺傷活性測(cè)定（最佳細(xì)胞密度、效/靶比及反應(yīng)時(shí)間由預(yù)實(shí)驗(yàn)得到）</p><p>　　以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Ｋ562細(xì)胞為靶細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105/ ml。以外周血單個(gè)核細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為4×106/ ml，效/靶比為10∶1，同時(shí)設(shè)靶細(xì)胞孔、效應(yīng)細(xì)胞孔和RPMI 1640空白對(duì)照孔。上述各孔均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞、R

18、PMI 1640孔各為50微升/孔（反應(yīng)孔），效應(yīng)細(xì)胞孔、靶細(xì)胞對(duì)照孔各為50微升/孔，RPMI 1640孔為100微升/孔加入40孔板；另設(shè)1孔加RPMI 1640培養(yǎng)液150微升/孔為調(diào)零點(diǎn)。充分混勻， 37℃、5% CO2培養(yǎng)4小時(shí) 。每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml)，繼續(xù)孵育4小時(shí)（以上都在超凈操作臺(tái)操作）。棄上清，每孔加DMSO 150 μl，充分吹打、混勻，10分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)OD值，按下述公

19、式計(jì)算殺傷率。</p><p>　?。危思?xì)胞殺傷率(%)=［1 - (實(shí)驗(yàn)孔OD值- 效應(yīng)細(xì)胞孔OD值) / 靶細(xì)胞孔OD值］×100%</p><p>　　紅細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的影響</p><p>　　紅細(xì)胞的制備 健康人、造血與淋巴組織腫瘤患者的EDTA抗凝新鮮全血（采集6小時(shí)之內(nèi)使用），經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）分離得到紅細(xì)胞，用生理鹽

20、水洗滌2次。</p><p>　　紅細(xì)胞的濃度 用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為4×106/ ml備用。紅∶效=1∶1。紅細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞一起放入靶細(xì)胞，加入后進(jìn)行培養(yǎng)，即進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)。以下步驟同 。</p><p><b>　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理</b></p><p>　　結(jié)果用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后分析，行獨(dú)立樣本檢測(cè)

21、 （independentsample T Test）。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示； p<0.05，差異有顯著性。</p><p><b>　　結(jié) 果</b></p><p>　　枸櫞酸鈉抗凝，在自身血漿條件下紅細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的免疫黏附形成了"玫瑰花"樣結(jié)合（圖1、2）。21例正常對(duì)照外周血紅細(xì)胞對(duì)K56

22、2細(xì)胞的免疫黏附結(jié)合率為（15.3±6.4）%，24例造血與淋巴組織腫瘤患者紅細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的免疫黏附結(jié)合率為（7.6±7.0）%（表1），與正常人相比顯著下降（t=3.61， p﹤0.001）。</p><p>　　從6名正常對(duì)照者外周靜脈血分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PBMNC的CD3-（CD16CD56）+ 細(xì)胞即NK細(xì)胞，結(jié)果顯示NK細(xì)胞占PBMNC的比例為7%-30%（

23、圖3），能夠滿(mǎn)足殺傷活性檢測(cè)需要。</p><p>　　Figure 3. Expression level of PBMNC CD3+(CD16CD56)+ cells (NK cells) detected by FCM.</p><p>　　不加紅細(xì)胞條件下，用MTT法測(cè)得6名正常人來(lái)源的NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞活性為67%-71%。檢測(cè)標(biāo)本時(shí)每次設(shè)立不加紅細(xì)胞的對(duì)照，加入紅細(xì)胞后測(cè)

24、得的結(jié)果減去對(duì)照，即得到紅細(xì)胞增加或減少NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞活性的百分率。結(jié)果表明，21名正常對(duì)照者的紅細(xì)胞明顯增加NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞活性，殺傷率為（14.7±5.2）%，而24例造血與淋巴組織腫瘤患者的紅細(xì)胞明顯地減低NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞活性，殺傷率為（-4.3±7.6）%（表2），二者比較有顯著差異（t=6.73， p﹤0.0001）。</p><p><b>　　

25、討 論</b></p><p>　　在外周血中，抗原及腫瘤細(xì)胞遇到紅細(xì)胞的機(jī)會(huì)比白細(xì)胞大1000倍，結(jié)合有抗體或補(bǔ)體的腫瘤細(xì)胞可通過(guò)C3b受體黏附到紅細(xì)胞上，易被吞噬細(xì)胞捕獲、吞噬［1］。Craig等［2］通過(guò)體外用雙特異性單克隆抗體反應(yīng)劑連接免疫復(fù)合物到紅細(xì)胞上的模型系統(tǒng)，揭示了免疫復(fù)合物絞鏈紅細(xì)胞到巨噬細(xì)胞的中間轉(zhuǎn)移過(guò)程。Hament等［3］用流式細(xì)胞儀分析表明，在人血清存在下肺炎球菌能結(jié)合

26、到人紅細(xì)胞上，紅細(xì)胞上的配體為補(bǔ)體受體1（CR1）。國(guó)內(nèi)郭峰［4］提出了"紅細(xì)胞天然免疫主干道理論"并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究［4，5］，他們認(rèn)為，各種致病性抗原進(jìn)入血循環(huán)首先旁路激活血漿中的補(bǔ)體等可溶性免疫分子，黏附上補(bǔ)體C3b等免疫分子后絕大多數(shù)被數(shù)量巨大的紅細(xì)胞補(bǔ)體受體免疫黏附處理，此后交給各種白細(xì)胞，激發(fā)一系列天然免疫與適應(yīng)性免疫反應(yīng)，最終將入侵的致病原消除。</p><p>　　王海濱等［6］

27、建立了紅細(xì)胞天然免疫黏附功能（ENIAF）的快速檢測(cè)方法，在對(duì)SARS的研究中獲得了許多原創(chuàng)性的成果。他們發(fā)現(xiàn)確診為SARS的病人在收住院1周內(nèi)其紅細(xì)胞天然免疫黏附功能即不同程度地下降，并且隨病情的加重持續(xù)降低，隨病情好轉(zhuǎn)開(kāi)始回升，SARS患者的紅細(xì)胞CR1數(shù)量下降，與ENIAF的變化密切相關(guān)，作者認(rèn)為ENIAF可作為臨床動(dòng)態(tài)觀(guān)察SARS病情發(fā)展變化、療效評(píng)估及預(yù)后判斷的重要參考指標(biāo)［7］。</p><p>　　

28、對(duì)造血與淋巴組織腫瘤患者，我們用紅白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞，外周血枸櫞酸鈉抗凝，在自身血漿中研究患者的紅細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞ENIAF的變化。結(jié)果表明，紅細(xì)胞在自身血漿條件下對(duì)K562細(xì)胞的免疫黏附形成了"玫瑰花"樣結(jié)合，患者紅細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的免疫黏附結(jié)合率為（7.6±7.0）%，與正常人的（15.3±6.4）%相比顯著下降（t = 3.61， p﹤0.001）。其他腫瘤患者紅細(xì)胞的黏

29、附功能與正常人的相比也明顯低下［8］。</p><p>　　ENIAF的變化與血沉、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值的變化顯著相關(guān), 與合并糖尿病、慢性肝炎也有關(guān)系［9］。自身免疫性肝病患者紅細(xì)胞免疫黏附活性顯著低于正常人群（p﹤0.01），并且與自身抗體的升高、病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)［10］。造血與淋巴組織腫瘤患者中ENIAF變化的原因與意義，尚需要進(jìn)一步研究。</p><p>　　NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè)多用

30、敏感細(xì)胞株如K562細(xì)胞，方法有MTT比色法、LDH釋放法、3HTdR參入法等。崔曉明等［11］研究結(jié)果表明，K562細(xì)胞數(shù)在（1-4）×104/孔時(shí)線(xiàn)性關(guān)系較好，效、靶作用的時(shí)間定為2小時(shí)，加MTT后再作用4小時(shí)，效、靶比選擇5∶1、10∶1結(jié)果較理想。王琦等［12］對(duì)MTT比色法進(jìn)行了改良，同時(shí)證明MTT比色法與3HTdR摻入法有高度的相關(guān)性（r = 0.96， p<0.01）。</p><p

31、>　　我們采用MTT法測(cè)定NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞的活性，發(fā)現(xiàn)不加紅細(xì)胞條件下，殺傷活性為67%-71%，與上面的結(jié)果一致。正常人紅細(xì)胞能使NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞活性的百分率明顯增加（14.7±5.2）%，造血與淋巴組織腫瘤患者的紅細(xì)胞卻使NK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞活性明顯降低（4.3±7.6）%，其原因需要進(jìn)一步研究。對(duì)破壞的紅細(xì)胞劉希英等［13］作了探討，他們制備紅細(xì)胞胞質(zhì)液，觀(guān)察紅細(xì)胞胞質(zhì)液對(duì)NK細(xì)胞殺

32、傷活性的影響。發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤病人NK細(xì)胞活性明顯低于正常對(duì)照組（F= 12.85， q = 7.86， p<0.01）；正常人紅細(xì)胞胞質(zhì)液可以顯著提高自身及病人NK細(xì)胞活性（F= 4.32-5.89， q = 3.96-4.49， p<0.05、0.01）。</p><p>　　在造血系統(tǒng)，許多證據(jù)提示NK細(xì)胞參與抗白血病免疫反應(yīng)［14］，NK細(xì)胞數(shù)量或活性與急性白血病的預(yù)后之間存在負(fù)相關(guān)，NK細(xì)胞活性

33、依賴(lài)性的免疫缺陷綜合征與淋巴、造血系統(tǒng)腫瘤發(fā)生率升高有關(guān)，NK細(xì)胞在異基因骨髓移植中的GVL效應(yīng)中起重要作用。Miller等［15］對(duì)NK細(xì)胞治療抗白血病的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示在較強(qiáng)的免疫抑制方案（HiCy/Flu）后輸注NK細(xì)胞造成了內(nèi)源性IL15的明顯上升及供體NK細(xì)胞的擴(kuò)增，并且在19例預(yù)后不佳的AML患者中5例產(chǎn)生了完全血液學(xué)緩解。</p><p>　　所以，紅細(xì)胞可能影響NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的活

34、性。進(jìn)一步研究造血與淋巴組織腫瘤患者紅細(xì)胞免疫與NK細(xì)胞免疫、DC功能、T、B細(xì)胞免疫等之間的關(guān)系，對(duì)于揭示其發(fā)病機(jī)制、發(fā)展更全面的治療策略可能具有重要的意義。</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　　1郭峰，錢(qián)寶華，張樂(lè)之主編. 現(xiàn)代紅細(xì)胞免疫學(xué). 上海：上海第二軍醫(yī)大學(xué)出版社. 2002：40</p><p>

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41、37-353</p><p>　　14Miller JS, Soignier Y, Panoskaltsis-Mortari A, et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood, 2005；105:3051-3057&