花生維生素E合成關(guān)鍵酶基因(VTE3、HPT)的克隆、序列分析與γ-tmt基因的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、維生素E是一種脂溶性抗氧化劑，對動(dòng)、植物和人體都有非常重要的生理作用。然而天然維生素E只能由光合細(xì)菌和綠色植物合成，人體必須從外界攝取。植物油是人體攝取維生素E的主要途徑?；ㄉ鳛橹匾挠土献魑?，是人體所需維生素E的重要來源之一。本研究基于花生EST序列，結(jié)合RT-PCR技術(shù)以及以基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增方法，首次從花生中克隆了維生素E合成途徑的關(guān)鍵酶基因2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基轉(zhuǎn)移酶基因（VTE3）和尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶

2、基因（HPT），并且分別克隆了13個(gè)不同類型花生栽培品種和6個(gè)二倍體野生種的VTE3 DNA序列，在比較各序列同源性的基礎(chǔ)上，對不同類型花生栽培品種是否有相同起源問題以及花生栽培種與各野生種之間的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析探討；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將擬南芥γ-維生素E甲基轉(zhuǎn)移酶基因（γ-tmt）轉(zhuǎn)入花生栽培品種得到T0代和T1代陽性轉(zhuǎn)化植株。取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 （1）從豐花2號(hào)、蘭娜1號(hào)和荔浦大花生3個(gè)栽培品種中分別克隆到2條V

3、TE3 cDNA片段，命名為rVTE3-1和rVTE3-2。品種間相應(yīng)序列同源性為100％。rVTE3-1和rVTE3-2的編碼區(qū)長1059 bp，均編碼351個(gè)氨基酸，二者核苷酸序列同源性97.8％，存在10個(gè)變異位點(diǎn)，其中8個(gè)為SNP變異；氨基酸序列同源性98.6％，存在5個(gè)氨基酸差異。
　　 （2）從花生栽培品種Krapt.st.16中克隆得到一條HPT cDNA片段，長1269 bp，命名為AhHPT。AhHPT最大開放

4、閱讀框?yàn)?230 bp，編碼含有409個(gè)氨基酸殘基，與大豆、苜蓿、木薯、擬南芥等16種植物的HPT蛋白序列同源性較高，為61.46％ ～79.71％。
　　 （3）從13個(gè)栽培品種分別克隆得到2條VTE3 DNA片段，命名為gVTE3-1和gVTE3-2。gVTE3-1在13個(gè)品種間核苷酸序列同源性為99.9％，gVTE3-2核苷酸序列同源性為100％。豐花2號(hào)gVTE3-1和gVTE3-2同源性96.6％，內(nèi)含子存在36個(gè)SN

5、P位點(diǎn)和3個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別的多態(tài)性位點(diǎn)。從6個(gè)二倍體野生花生分別克隆得到一條VTE3 DNA片段，A染色體組4個(gè)野生種以及B染色體組野生種A.Batizocoi的gVTE3同源性達(dá)99.9％以上，僅有2個(gè)堿基的差異。B染色體組野生種A.Ipaensis的gVTE3與其余野生種gVTE3同源性相對較低，為97.0％。A.Ipaensis的gVTE3與豐花2號(hào)gVTE3-2同源性100％；豐花2號(hào)gVTE3-1與A染色體組野生種的gVTE

6、3同源性相對較高，最高為98.7％。進(jìn)化樹分析顯示，豐花2號(hào)的gVTE3-2與A.Ipaensis的gVTE3聚為一組；A染色體組4個(gè)野生種和B染色體組野生種A.Batizocoi的gVTE3以及豐花2號(hào)gVTE3-1聚為一組。
　　 （4）得到164株具有PPT抗性并且PCR檢測目的基因（γ-tmt）呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)擴(kuò)繁后移栽成活T0代單株560個(gè)，獲得其T1代種子；獲得來自34個(gè)株系T1代單株356個(gè)，經(jīng)PCR檢測其中