紫花苜蓿維生素E合成基因γ-TMT,HPT和HPPD的分離,遺傳轉(zhuǎn)化及功能分析.pdf

1、紫花苜蓿（Medicago Sativa L.）是異花授粉的同源四倍體且基因組龐大，復(fù)雜的遺傳背景限制了其有價值基因的發(fā)掘和利用。維生素E的合成途徑在多個物種中都進(jìn)行了深入研究，然而關(guān)于紫花苜蓿維生素E的合成卻鮮有報道。為了提高紫花苜蓿的營養(yǎng)價值，優(yōu)化紫花苜蓿的維生素E含量和組分，本研究以紫花苜蓿中苜一號（Medicago Sativa L.vs Zhongmu No.1）為材料克隆得到維生素E合成途徑的γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶（γ-TMT

2、），尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶（HPT）和4-羥苯丙酮酸雙加氧酶（HPPD）并進(jìn)行研究，取得如下進(jìn)展：
　　1.以紫花苜蓿葉片為實驗材料，采用cDNA末端快速擴增技術(shù)（RACE）克隆得到γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶（γ-TMT）。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，紫花苜蓿MsTMT與截形苜蓿MtTMT高度同源，說明我們成功從紫花苜蓿中克隆得到了γ-TMT并將其命名為 MsTMT。熒光定量PCR分析結(jié)果表明，該基因在整株植物中均有表達(dá)，其中葉片中表達(dá)量最高，花中表

3、達(dá)量最低。NaCl、15％PEG、黑暗和脫落酸均可以誘導(dǎo)MsTMT的表達(dá)，而低溫則抑制MsTMT的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中α-生育酚的含量顯著增加，葉片中維生素E的組分和含量則沒有變化。同時轉(zhuǎn)基因擬南芥內(nèi)源維生素E合成基因的表達(dá)量均未受到影響。甘露醇處理條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的發(fā)芽率，以及生物量顯著高于對照，CAT和POD活性在轉(zhuǎn)基因擬南芥中顯著提高，而且滲透脅迫的標(biāo)志基因的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中顯著上調(diào)，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥與對照相比抗逆性

4、增強。轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿葉片中α-生育酚和α-生育三烯酚含量以及粗蛋白的含量均有增加，并且在黑暗誘導(dǎo)條件下轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的衰老與對照相比有所延緩。說明MsTMT在不影響紫花苜蓿品質(zhì)的同時還可以調(diào)控轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的葉片衰老過程，因此可以做為紫花苜蓿品質(zhì)改良的候選基因。
　　2.以紫花苜蓿葉片為實驗材料，采用cDNA末端快速擴增技術(shù)（RACE）克隆得到尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶（HPT）的cDNA序列，該基因有一個1236bp的完整開放閱讀框，編碼

5、411個氨基酸，屬于異戊烯轉(zhuǎn)移酶UbiA家族，有異戊烯轉(zhuǎn)移酶HPT1保守結(jié)構(gòu)域。多序列比對分析結(jié)果顯示，該蛋白與其他物種的HPT高度同源，蛋白序列相似度達(dá)80%，由此證明我們成功克隆得到紫花苜蓿HPT基因，并命名為MsHPT。通過染色體步移技術(shù)獲得1.9Kb啟動子序列，序列分析表明，紫花苜蓿MsHPT啟動子區(qū)域除含有大量的核心啟動子元件TATA和CAAT之外，還有脫落酸、乙烯、赤霉素、茉莉酸甲酯等激素反應(yīng)元件以及大量的與光反應(yīng)有關(guān)的作用

6、元件。實時熒光定量PCR技術(shù)分析MsHPT在各組織中的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，MsHPT基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，葉片中表達(dá)量最高。15%PEG，NaCl，赤霉素和脫落酸均可一定程度上誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。該基因?qū)γ{迫的廣泛響應(yīng)，說明該基因可能在紫花苜?？鼓嫘陨暇哂幸欢ǖ淖饔?。
　　3.以紫花苜蓿葉片為實驗材料，采用 cDNA末端快速擴增技術(shù)（RACE）克隆得到紫花苜蓿4-羥基丙酮酸轉(zhuǎn)移酶cDNA，cDNA序列分析結(jié)果表明，其包含13

7、05bp的開放閱讀框，編碼434個氨基酸，屬于Glo_EDI_BRP_like超家族，在序列的C和N末端各包含一個HPPD結(jié)構(gòu)域，并且C端富含活性位點。多序列比對結(jié)果表明，紫花苜蓿HPPD與來自其他物種的HPPD相似性達(dá)到82.46%，三個決定該酶活性的鐵結(jié)合位點在不同的HPPD中高度保守， 因此我們將該基因命名為MsHPPD。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，MsHPPD在紫花苜蓿的各個組織中均有表達(dá)，其中在葉片中表達(dá)量最高。通過

8、染色體步移技術(shù)獲得該基因的啟動子序列，并連入pBI121載體中，通過GUS染色分析結(jié)果表明，MsHPPD在擬南芥的子葉，主根，萼片，花瓣，柱頭，絲管，花粉以及種子果莢的末端都有強烈的GUS表達(dá)。真葉，根尖以及下胚軸中沒有GUS的表達(dá)。NaCl、脫落酸、PEG和黑暗都可以誘導(dǎo)MsHPPD的表達(dá)。將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中β-生育三烯酚以及維生素E總量含量顯著高于對照。且轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在正常環(huán)境下發(fā)芽時間顯著早于對照，而在甘露

9、醇和NaCl處理條件下發(fā)芽率顯著高于對照，并且對ABA處理不敏感。ABA含量測定結(jié)果表明，在干種子中ABA的含量在轉(zhuǎn)基因擬南芥和對照中差異不顯著，但在浸水36h的種子中，轉(zhuǎn)基因擬南芥ABA的含量顯著低于對照。同時，在干種子中，ABA合成基因NCED3,5,9以及ABA信號途徑的基因ABI3和ABI5的表達(dá)量在轉(zhuǎn)基因擬南芥和對照中表達(dá)差異不顯著，而浸水后，表達(dá)量與對照相比均顯著降低。而MsHPPD的表達(dá)量在浸水顯著升高。將pBI121-M