致鵝敗血癥糞腸球菌鑒定及溶血素激活因子原核表達(dá).pdf

1、1、對(duì)從通遼某祖代和父母代鵝場(chǎng)主要表現(xiàn)昏睡、持續(xù)性下痢、跛行和癱瘓癥狀,呈現(xiàn)急性敗血癥病理特征的20～30日齡仔鵝心臟、肝臟、淋巴結(jié)和腦組織液等組織分離的4株細(xì)菌,進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生長(zhǎng)耐受試驗(yàn)、毒力因子表型試驗(yàn)、生化試驗(yàn)等表型特征鑒定,16SrDNA檢測(cè)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果接觸媒試驗(yàn)和發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)陰性、吡咯烷酮芳胺酶試驗(yàn)和膽汁-七葉苷試驗(yàn)陽(yáng)性,在pH9.6、10℃、45℃、60℃30min、6.5％NaCl等條件下能生長(zhǎng),動(dòng)力試驗(yàn)

2、陽(yáng)性。甘露醇、山梨醇、山梨糖等糖(醇)類發(fā)酵試驗(yàn)分別為陽(yáng)性、陽(yáng)性和陰性,精氨酸雙水解酶試驗(yàn)陽(yáng)性。亞碲酸鹽和丙酮酸鹽利用試驗(yàn)陽(yáng)性,依羅霉素敏感試驗(yàn)?zāi)退?甲基葡萄糖吡喃糖苷產(chǎn)酸試驗(yàn)陰性。乳糖、水楊素發(fā)酵試驗(yàn)陽(yáng)性,蔗糖、阿拉伯糖、棉子糖、木糖發(fā)酵試驗(yàn)為陰性。4株分離菌與參考菌株ATCC29212及國(guó)內(nèi)分離的典型菌株GU385352等糞腸球菌菌株16SrDNA的同源性均在99.0％以上。致病性試驗(yàn)小鼠半數(shù)致死量為1011.2。確定本次從鵝體內(nèi)分

3、離的4株細(xì)菌均為中等致病性糞腸球菌,命名為TLME3株。
　　 2、為探討致鵝敗血癥糞腸球菌TLME3株毒力基因溶血素激活因子(Cytolysin Activator,CylA)的變異性,研究其功能變化與基因變異的關(guān)系。本試驗(yàn)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Genbank上糞腸球菌溶血素激活因子基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,用PCR擴(kuò)增,連接到pMD18-T載體上,應(yīng)用PCR及酶切方法檢測(cè)出陽(yáng)性克隆并進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果TLME3的溶血素激活因子基

4、因序列與Genbank上L37110、AF329367、AF454824、AY032999的溶血素激活因子基因序列同源性均在99.4％以上。與國(guó)內(nèi)豬源分離株HE1、HE9、HE12、HE30該基因的同源性在99.0％以上,其中與HE9的同源性最高為99.8％。在50bp、385bp、484bp、666bp等處有變異。結(jié)果表明,本試驗(yàn)成功克隆獲得致鵝敗血癥糞腸球菌溶血素激活因子基因,該基因高度保守,與L37110等菌株高度同源,僅個(gè)別核苷

5、酸處有變異。
　　 3、為給研究致鵝敗血癥糞腸球菌TLME3株毒力基因溶血素激活因子的功能奠定基礎(chǔ)。將TLME3溶血素激活因子基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中,構(gòu)建pET-CylA重組質(zhì)粒,經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。用High-Affinity GST Resin純化表達(dá)的融合蛋白,并進(jìn)行SDS-PAGE分離和Western-Blot檢測(cè)分析。結(jié)果得到