分子標(biāo)記技術(shù)在水產(chǎn)動物表型性狀遺傳分析中的應(yīng)用【文獻(xiàn)綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　分子標(biāo)記技術(shù)在水產(chǎn)動物表型性狀遺傳分析中的應(yīng)用</p><p>　　摘要：綜述了DNA 分子標(biāo)記技術(shù)的類型及代表性分子標(biāo)記技術(shù)的基本原理和優(yōu)缺點(diǎn)。 隨著DNA 分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展, 其在動物遺傳上發(fā)揮了

2、重大作用, 使用DNA 分子標(biāo)記可以觀察到整個基因組的遺傳多樣性。DNA 分子標(biāo)記的應(yīng)用使得人們對遺傳多樣性、近親繁殖、種類和品系鑒定以及遺傳連鎖圖譜建立的研究都取得了很大進(jìn)展, 也加快了數(shù)量性狀位點(diǎn)( QTL) 基因的鑒定作為分子標(biāo)記輔助選擇( MAS) 的研究。</p><p>　　關(guān)鍵字：分子標(biāo)記 遺傳 技術(shù) </p><p>　　近年來, 隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展, 誕生了一系列

3、DNA 分子標(biāo)記技術(shù), 如限制性片斷長度多態(tài)性( restriction fragment length polymorphism,簡稱RFLP) 、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA( randomamplified polymorphic DNA, 簡稱RAPD) 、擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, 簡稱AFLP) 、簡單序列長度多態(tài)性(simple sequence length

4、 polymorphism, 簡稱SSLP)、隨機(jī)擴(kuò)增微衛(wèi)星多態(tài)性(Random amplified microsatillitepolymorphism, 簡稱RAMP) 、序列標(biāo)簽位點(diǎn)( Sequence-tagged sites, 簡稱STS) 、DNA 擴(kuò)增指紋(DNA amplified fingerprinting, DAF) 、擴(kuò)增子長度多態(tài)性( amplicon length polymorphism, 簡稱ALP)、特

5、異擴(kuò)增子多態(tài)性( Specific ampiliconpolymorph</p><p>　　1、分子標(biāo)記技術(shù)的種類、基本原理及優(yōu)缺點(diǎn)</p><p><b>　　1.1 RFLP</b></p><p>　　RFLP 是Grodzicker 于1974 年創(chuàng)立的。該技術(shù)最早用于DNA 水平上的品種鑒定分析。其基本原理是首先利用特定的限制性內(nèi)切

6、酶將生物基因組DNA 進(jìn)行酶切, 獲得大小不等的DNA片斷, 然后通過凝膠電泳分析形成不同的條帶,最后經(jīng)Southern 雜交和放射自顯影, 即可揭示出DNA 的多態(tài)性。但是, 由于RFLP 的技術(shù)要求高,檢測時間長, 且成本較高, 使得大規(guī)模應(yīng)用受到限制。</p><p><b>　　1.2 RAPD</b></p><p>　　RAPD 是1990 年由美國杜邦公

7、司科學(xué)家Williams 和加利福尼亞生物研究所的Welsh 等發(fā)明的一種分子標(biāo)記技術(shù)。它是以基因組DNA 為模板, 以一個隨機(jī)的寡核苷酸序列作引物, 通過PCR 擴(kuò)增, 產(chǎn)生不連續(xù)的DNA 產(chǎn)物, 用以檢測DNA 序列的多態(tài)性。它可以在對物種沒有任何分子生物學(xué)研究的情況下, 對其進(jìn)行基因組指紋圖譜的構(gòu)建。與RFLP 技術(shù)相比, 具有DNA 用量少、簡單快速、引物無種屬特異性和不使用放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)。但是RAPD 技術(shù)也有以下不足之處

8、: ( 1) 穩(wěn)定性差, 結(jié)果重復(fù)性不好;( 2)RAPD 一般為顯性標(biāo)記, 不能鑒定雜合子;( 3)RAPD 標(biāo)記在基因組中分布不均勻, 每個標(biāo)記提供的信息量較少。</p><p><b>　　1.3 AFLP</b></p><p>　　AFLP 是荷蘭Keygene 公司Zabeau 等發(fā)明的一種DNA 分子標(biāo)記技術(shù)。其基本原理是選擇性擴(kuò)增基因組DNA 的酶切片

9、段, 由于不同材料的DNA 酶切片段存在差異, 因而便產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。選擇性擴(kuò)增是通過在引物3’端加上選擇性核苷酸而這現(xiàn)的, 改變選擇性核苷酸的數(shù)目, 就可以預(yù)先決定所要擴(kuò)增的片段的數(shù)目。研究表明, AFLP 產(chǎn)生的多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過RFLP 和RAPD 等技術(shù), 因而被認(rèn)為是指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最豐富的一項技術(shù)。但該技術(shù)已申請專利, 在生產(chǎn)及商業(yè)上的應(yīng)用受到一定的限制。</p><p><b>　

10、　1.4 SSR</b></p><p>　　SSR 是簡單序列重復(fù), 稱為微衛(wèi)星DNA(microsatallite DNA) , 是近幾年在PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第二代分子標(biāo)記。SSR 是一種真核生物基因組中普遍存在的重復(fù)序列, 重復(fù)序列一般由1～6 個堿基組成, 重復(fù)次數(shù)在不同物種或同一物種不同基因型之間是高度可變的。這些重復(fù)序列兩端大多是保守的單拷貝序列, 因此可以根據(jù)保守序列設(shè)計特異引物,

11、 通過PCR 技術(shù)將中間的核心重復(fù)序列擴(kuò)增出來, 利用瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分析技術(shù)可獲得其長度多態(tài)性。SSR 具有RFLP 的所有遺傳學(xué)優(yōu)點(diǎn), 且避免了RFLP 技術(shù)中的使用放射性同位素的缺點(diǎn), 又比RAPD 的重復(fù)性和穩(wěn)定性高, 因而目前已成為遺傳標(biāo)記中的研究熱點(diǎn)。然而由于SSR 技術(shù)必須針對每個染色體座位的微衛(wèi)星, 發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列才能設(shè)計引物, 這給微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)帶來一定的困難。</p><p

12、><b>　　1.5 ISSR</b></p><p>　　ISSR 是一種新型的分子標(biāo)記, 是由Zietkiewecz 于1994 年創(chuàng)建的一種簡單序列重復(fù)間擴(kuò)增多態(tài)性的分子標(biāo)記。它的生物學(xué)基礎(chǔ)仍然是基因組中存在的SSR。ISSR 標(biāo)記根據(jù)生物體中廣泛存在SSR 的特點(diǎn), 利用生物體基因組中出現(xiàn)的SSR 本身設(shè)計引物, 無需預(yù)先克隆和測序。ISSR 通常為顯性標(biāo)記, 呈Mendel

13、式遺傳, 且具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性, 因而是非常理想的分子標(biāo)記之一, 可用于構(gòu)建PCR 為基礎(chǔ)的分子圖譜。但它與RAPD 相似, 不能鑒別檢測位點(diǎn)的純合與雜合狀態(tài)。</p><p><b>　　1.6 SNP</b></p><p>　　1994 年, SNP 這個術(shù)語第一次出現(xiàn)在人類分子遺傳雜志上, 隨后Lander[13]第一次正式提出SNPs 為新一代分子標(biāo)記

14、。簡單地講, 它是指基因組DNA 序列中由于單個核苷酸(A, T, C, G) 的替換而引起的多態(tài)性。因此, 通常所說的SNPs 不包括堿基的插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。</p><p>　　SNP 是繼RFLP 和SSR 之后發(fā)展起來的第三代分子標(biāo)記技術(shù)。與前兩代分子標(biāo)記技術(shù)相比, 它具有以下優(yōu)點(diǎn): ( 1) 數(shù)量多, 分布廣泛。它是目前為止分布最為廣泛、存在數(shù)量最多且標(biāo)記密度最高的一種遺傳多態(tài)性標(biāo)記;

15、 ( 2) 遺傳穩(wěn)定性高, 遺傳分析重現(xiàn)性好且準(zhǔn)確性高; ( 3) 易于快速且高通量地進(jìn)行基因型分型。由于SNP 的二態(tài)性, 非此即彼, 在基因組中往往只需＋ /－的分析, 而無須象檢測SSR 標(biāo)記那樣分析片段的長度, 這就有利于自動化的篩選或檢測技術(shù)的開發(fā)。</p><p>　　2、水產(chǎn)動物的表型性狀遺傳特點(diǎn)</p><p>　　2．1與鯉魚抗寒性狀相關(guān)的RAPD 分子標(biāo)記在利用RAPD

16、2PCR 技術(shù)研究鯉魚抗寒性狀的過程中,最希望得到的是抗寒的父本和越冬存活的F2代混合樣具有的分子標(biāo)記,而不抗寒的母本和越冬死亡的F2代混合樣都不具有的分子標(biāo)記。但在本研究中發(fā)現(xiàn),所篩選到的幾個標(biāo)記都是抗寒親本具有、不抗寒親本不具有,而兩個F2代混合樣都具有,但在PCR 擴(kuò)增量上抗寒與不抗寒F2代存在差異,即產(chǎn)生了一個拷貝數(shù)差異的圖譜。分析認(rèn)為,魚類在越冬過程中引起死亡的原因有很多,遺傳因素決定其不抗寒是引起越冬死亡的主要因素,由于操作

17、不當(dāng)對魚體產(chǎn)生損傷引發(fā)疾病也是產(chǎn)生死亡的一個因素。因此在越冬過程中很可能造成的極少數(shù)具有抗寒能力的子代混入到死亡群體中,從而產(chǎn)生上述的結(jié)果。另外,作者認(rèn)為魚類在某些與抗寒相關(guān)基因的表達(dá)量上存在一定的差異,而表達(dá)量達(dá)不到一定水平很可能是引起越冬死亡的另一個因素。在以往利用分子標(biāo)記進(jìn)行抗寒分析過程中,筆者獲得了許多與抗寒性狀相關(guān)的分子標(biāo)記,據(jù)此確定魚類的抗寒性狀是受多基因控制的是一個數(shù)量性狀,一個基因拷貝數(shù)的不同對抗寒魚群體之間的遺傳不同有

18、很大的影響。而在提高鯉魚抗寒能力的育種研究過程中,親本將抗寒性</p><p>　　由于RAPD 技術(shù)具有的操作簡單、快捷、無需知道目標(biāo)序列的有關(guān)信息、無種屬特異性等優(yōu)點(diǎn),這對研究背景相對貧乏的魚類抗寒研究進(jìn)入基因組水平是非常有意義的。但由于RAPD 技術(shù)存在的重復(fù)性差、實驗結(jié)果不具有可比性等缺陷使其在數(shù)量性狀基因的定位等研究上難以進(jìn)行。Weeden 等的研究也表明,RAPD 技術(shù)本身存在5 %～10 %的檢測誤

19、差。因此目前采用的RAPD 技術(shù)并不是進(jìn)行魚類抗寒研究的最好方法。在今后的研究中,應(yīng)該更多的采用共顯性分子標(biāo)記。同時,在實驗過程中,雖然通過嚴(yán)格的控制實驗條件,比如,獲得高質(zhì)量的模板、穩(wěn)定高效的Tag 酶、優(yōu)化的反應(yīng)條件、專一的實驗器材,利用RAPD 技術(shù)依然能夠得到重復(fù)性好,且比較穩(wěn)定的實驗結(jié)果。但是其信息量少,進(jìn)行常規(guī)PCR 困難等缺點(diǎn),需要將其轉(zhuǎn)化為共顯性分子標(biāo)記才得以解決。SCAR 標(biāo)記作為一種共顯性的分子標(biāo)記具有的重復(fù)性好、信

20、息量大等一些優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)被越來越多的國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用。比較RAPD 分子標(biāo)記而言,這種共顯性的SCAR 標(biāo)記更加適合魚類抗寒性狀方面的研究,在魚類耐寒育種研究問題上具有更加廣闊的應(yīng)用前景。</p><p>　　2.2對蝦抗病性狀遺傳標(biāo)記</p><p>　　抗病性狀一般有多個基因控制。分子標(biāo)記輔助育種主要用于單基因或少數(shù)基因的遺傳轉(zhuǎn)移和抗病性狀多個基因的聚合。在抗病性育種實踐中，單個基因控制的

21、抗性品種容易被病原體克服而造成大面積流行。因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)對抗病基因進(jìn)行標(biāo)記和定位，然后將不同的抗性基因聚合到一個優(yōu)良品種中，可能會產(chǎn)生新的抗性或使抗性得到提高，從而有利于培育具有持久抗性的品系或品種 (周錦霞等2005)。Huang等(1997)用分子標(biāo)記在雜交F4代將4個抗白葉枯基因(Xa一44，Xa一5，Xa一13和Xa一21)聚于IRBB60品系中。王心宇等(2001)采用在早代進(jìn)行抗性鑒定，較晚世代(F4代)進(jìn)行抗性鑒定

22、結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇的策略，利用了與3個小麥白粉病抗性基因緊密連鎖或共分離的RFLP標(biāo)記和PCR標(biāo)記 (SCAR標(biāo)記)，對含有這些基因的優(yōu)良品系間配制的雜交組合的F4代進(jìn)行了分子標(biāo)記輔助育種選擇，并結(jié)合抗性鑒定，篩選到共36株結(jié)合其中兩個抗性基因的植株。</p><p>　　本研究利用RAPD技術(shù)對在攻毒過程中分離出的兩個群體進(jìn)行分析，得到7個在兩個群體中表型頻率差異顯著的位點(diǎn)，其中5個位點(diǎn)在SLT群體中的表型頻

23、率顯著高于SST群體，說明這5個位點(diǎn)可能與抗病性狀相關(guān)。另外，兩個位點(diǎn)S1020—4和S1176—4在SST群體中的表型頻率顯著高于在SLT群體，說明這兩個位點(diǎn)可能是與抗病負(fù)相關(guān)的特異性遺傳標(biāo)記。其中引物SLO2O產(chǎn)生兩個特異性位點(diǎn)，一個與抗病正相關(guān)位點(diǎn)SLO2O一1，一個負(fù)相關(guān)位點(diǎn)S1020—4。利用這些與抗病相關(guān)的遺傳標(biāo)記進(jìn)行輔助育種，可以大大加快育種進(jìn)程。</p><p>　　3、分子標(biāo)記技術(shù)的在水產(chǎn)動物表

24、型性狀遺傳研究中的應(yīng)用</p><p>　　3.1　RAPD技術(shù)在魚類、蝦蟹類研究中的應(yīng)用</p><p>　　3.1.1在遺傳資源研究中的應(yīng)用</p><p>　　目前，海產(chǎn)蝦、蟹類遺傳變異的檢測大多通過檢測同工酶的變異來進(jìn)行，所揭示的同工酶的多態(tài)性相對較低。RAPD分析中所需的樣品量極少，其操作程序簡單易行，實驗周期短，因而可以對數(shù)量較多的樣品進(jìn)行分析。利用一套

25、引物可得到不同種屬、品系、群體甚至是個體的大量的RAPD分子標(biāo)記，并可借助于計算機(jī)進(jìn)行系統(tǒng)分析，RAPD技術(shù)的這些特點(diǎn)使得它可以在蝦、蟹類群體遺傳學(xué)、遺傳多樣性分析中發(fā)揮重要作用。</p><p>　　RAPD標(biāo)記可以用來進(jìn)行蝦、蟹類群體遺傳學(xué)研究，檢測種群內(nèi)、種群間的遺傳多樣性水平，并為種群識別提供可靠的遺傳標(biāo)記。Garcia等嘗試在斑節(jié)對蝦中利用RAPD分析不同地理群體間的遺傳多樣性，并就其在蝦類選育中的應(yīng)用

26、作了初步探討。Garcia以及A1civar—Warren等在高健康(High Health Shrimp)和無特異病原(Specific—Pathogen—Free,SPF)的南美白對蝦培育中，用RAPD技術(shù)對野生種群以及不同的家系進(jìn)行監(jiān)測和分析，發(fā)現(xiàn)其多態(tài)位點(diǎn)的比例為50%左右，其中一個家系的多態(tài)位點(diǎn)比例高達(dá)77%。劉萍等用RAPD技術(shù)對中國對蝦黃渤海沿岸種群親本及子一代的基因組DNA多態(tài)性進(jìn)行了研究，結(jié)果證實子代之間的遺傳距離比其

27、父母與子代之間更小，遺傳變異程度更低。邱高峰等用RAPD技術(shù)分析了我國近海煙臺、長島等4個地方的20只中國對蝦的種群內(nèi)和種群間遺傳差異，結(jié)果表明不同地理種群之間存在一定程度的遺傳差異。石拓等,劉萍等、劉振輝等對中國對蝦不同地理種群的遺傳多樣性進(jìn)行了RAPD分析，結(jié)果表明，中國對蝦的遺傳多樣性水平較低。高志干等對中華絨螯蟹的遼河和長江種群進(jìn)行RA</p><p>　　一個較為詳細(xì)的遺傳連鎖圖譜不僅對該物種的遺傳學(xué)基

28、礎(chǔ)研究有重要意義，同時對該物種的育種研究也很有幫助。Potlethwait和Stephen等用RAPD技術(shù)進(jìn)行斑馬魚遺傳連鎖圖譜的制作。Liu把RAPD技術(shù)應(yīng)用到鯰魚基因圖譜研究中。孫效文等建立了鯉魚的遺傳連鎖圖譜。圖譜有RAPD分子標(biāo)記56個，鯉魚的SSLP標(biāo)記26個，鯽魚的SSLP標(biāo)記有19個，斑馬魚的SSLP標(biāo)記有70個，鯉魚基因標(biāo)記91個，圖譜有50個連鎖組，連鎖圖給出鯉魚的基因組大小在5789cm左右。</p>

29、<p>　　3.1.2確定種、品種間的親緣關(guān)系種群親緣關(guān)系的傳統(tǒng)研究方法是從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生化指標(biāo)等方面進(jìn)行，但受個體和環(huán)境的影響較大，有時不能反映物種本身所固有的特征。物種基因組的組成在RAPD圖譜上得到體現(xiàn)，親緣關(guān)系越近，基因組中的同緣序列越多，則以相同引物擴(kuò)增出的共有標(biāo)記也就越多。因此，RAPD技術(shù)與傳統(tǒng)方法結(jié)合是研究物種親緣關(guān)系的有效手段。對不同種、同種不同群體的DNA進(jìn)行RAPD分析，篩選出特征性條帶，計算相似系

30、數(shù)和遺傳距離，從而可確定它們的親緣關(guān)系。李思發(fā)等用RAPD技術(shù)研究中國沿海六水系絨螯蟹(中華絨螯蟹和日本絨螯蟹)群體的親緣關(guān)系，從48個引物中篩選出2個具有群體特異性的引物，其中Z2擴(kuò)增的880bp片段為珠江蟹和南流江蟹兩群體所共有，擴(kuò)增的700bP片段為長江蟹、黃河蟹、遼河蟹、甌江蟹四群體所特有。這可作為區(qū)別中華絨螯蟹(長江蟹、黃河蟹、遼河蟹、甌江蟹)和日本絨螯蟹(珠江蟹、南流江蟹)的分子遺傳標(biāo)記。用RAPD技術(shù)對中國沿海六水系絨螯蟹

31、進(jìn)行兩大類型劃分與生化遺傳差異分析、形態(tài)特征多元分析的結(jié)果一致。宋林生等用RAPD方法研究對蝦屬六個種間的親緣關(guān)系，用20個隨機(jī)引物擴(kuò)增，共得</p><p>　　Borrwsky等用隨機(jī)引物擴(kuò)增產(chǎn)物重新構(gòu)建了脊椎動物DNA指紋圖。Sultman等用DNA標(biāo)記對麗魚科魚類的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了研究。何舜平等運(yùn)用RAPD的方法對五種鯉科魚類進(jìn)行了分析，并論述了鮈鯽的系統(tǒng)位置。何舜平等通過對鯉科魚類的隨機(jī)擴(kuò)增，獲得了大量有

32、系統(tǒng)發(fā)育信息的DNA多態(tài)片段，并繪制了低等鯉科魚類代表屬種的分支系統(tǒng)圖。夏德全等用RAPD方法分析太湖大銀魚、太湖新銀魚和寡齒新銀魚的親緣關(guān)系，同時發(fā)現(xiàn)有個別樣品的核基因組與太湖中已有的幾種銀魚有顯著差異。鄒曙明等用RAPD方法研究草魚、柏氏鯉和3個地理種群鯉的親緣關(guān)系，研究結(jié)果支持中國東部魚類具有雙重來源性的觀點(diǎn)。</p><p>　　3.1.3特定基因的標(biāo)記</p><p>　　利用D

33、NA分子水平上的變異作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因標(biāo)記已成為可能。周開亞等用RAPD方法研究鑒別中華絨螯蟹種群，用200個隨機(jī)引物對中華絨螯蟹遼河種群、長江種群和甌江種群進(jìn)行RAPD分析，其中引物HX01和HX02檢測到甌江種群和遼河種群所有樣品共有HX01—0.4和HX02—0.7擴(kuò)增片段；而長江種群樣品的PCR反應(yīng)中無這兩個擴(kuò)增片段出現(xiàn)，因而可作為長江種群的鑒別標(biāo)記。未發(fā)現(xiàn)可區(qū)分甌江種群和遼河種群的標(biāo)記。謝浩等用RAPD方法研究三種絨螯蟹的親

34、緣關(guān)系，用引物OPO—05對25個中華絨螯蟹個體、27個日本絨螯蟹個體及12個日本絨螯蟹合浦亞種個體擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹所有個體都能擴(kuò)增出一條大小約為1kb的區(qū)帶，且相當(dāng)明顯和穩(wěn)定，而其它兩種在相同條件下僅有個別個體能擴(kuò)增出相當(dāng)微弱的區(qū)帶。因此，可將這一區(qū)帶作為一個遺傳標(biāo)記，用于鑒別中華絨螯蟹與日本絨螯蟹及其合浦亞種。</p><p>　　目前RAPD已廣泛應(yīng)用于鑒別、鑒定不同的生物種類。Johnson用RAPD

35、技術(shù)鑒定了不同實驗室品系的斑馬魚。薛國雄對長江、珠江、黑龍江三大水系的草魚產(chǎn)卵場及太湖中捕撈的草魚進(jìn)行覆蓋性的RAPD分析，結(jié)果表明每一水系的草魚種群均有其特征性基因圖譜，可作為種群鑒定的依據(jù)。夏德全等應(yīng)用該技術(shù)檢測了一個奧利亞羅非魚養(yǎng)殖群體和湘湖，美國和沙市三個尼羅羅非魚養(yǎng)殖群體，獲得了鑒別尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚的分子遺傳標(biāo)記。姚紀(jì)花等利用20個隨機(jī)引物對產(chǎn)于方正、彭澤和淇河地區(qū)的三個銀鯽種群進(jìn)行了RAPD檢測，也獲得了銀鯽種群鑒定

36、的分子標(biāo)記。鄧懷等對青魚、草魚、鰱魚、鳙魚、鯽魚、鯉魚、團(tuán)頭魴、胭脂魚、土鯰和黃顙魚進(jìn)行了RAPD—PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示RAPD是一種非常靈敏的種間鑒定技術(shù)，特別是對魚卵和魚苗的鑒定有重要意義。鄭光明等以池養(yǎng)的鯪、麥鯪為材料，提取血液基因組DNA，利用隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過縮短擴(kuò)增時間和電泳時間，快速鑒定了三種不同的鯪魚，并建立了一套DNA分子水平上的快速鑒定魚種的方法。</p><p>　　3.1.4識別

37、同一物種的性別差異</p><p>　　蝦、蟹的性染色體沒有統(tǒng)一的模式，用常規(guī)核型分析方法不能鑒別性染色體。通過RAPD技術(shù)可找出同一物種不同性別的基因組DNA特征性條帶，從而有助于研究性別控制機(jī)制，也可為性別確定提供分子依據(jù)。邱濤用RAPD技術(shù)識別中華絨螯蟹的性別，200個引物中有17個引物擴(kuò)增出群體水平的差異，其中一個引物(OPM14)擴(kuò)增出個體水平的差異：雄性有一個800bP的特異帶，而雌性沒有。這可作為有

38、價值的性別鑒別標(biāo)記。</p><p>　　3.1.5監(jiān)測遺傳滲入，維持物種遺傳多樣性</p><p>　　目前，人為的養(yǎng)殖活動、人工放流等使得蝦、蟹類種內(nèi)不同種群間非自然的遺傳滲入已相當(dāng)普遍，應(yīng)引起重視，需加以監(jiān)測并收集數(shù)據(jù)，為保護(hù)種質(zhì)資源、維持物種遺傳多樣性提供依據(jù)。李思發(fā)等用RAPD指紋標(biāo)記研究中國大陸六水系絨整蟹的親緣關(guān)系，引物OPP17擴(kuò)增的947bP片段的出現(xiàn)頻率，在長江、黃河、

39、遼河三群體中顯著地從南到北遞減，長江蟹87.5%、黃河蟹41.66%、遼河蟹10.83%。這一遺傳滲入的度量可作為區(qū)別三水系中華絨螯蟹的判據(jù)。邱濤等用RAPD方法研究中華絨螯蟹長江、遼河、甌江水系三群體的遺傳多樣性，并未發(fā)現(xiàn)三群體間存在特征性條帶，但群體間差異大于群體內(nèi)差異。未發(fā)現(xiàn)群體間的分子遺傳標(biāo)記，但三群體間確實存在差異，表明近來種質(zhì)資源混雜，遺傳滲入是其中原因之一。 RAPD標(biāo)記可用于群體遺傳學(xué)研究，檢測種群內(nèi)、種群間的遺

40、傳多樣性水平，并為種群識別提供可靠的遺傳標(biāo)記。Bardakci等用RAPD技術(shù)評估了羅非魚的種群內(nèi)、種群間的遺傳變異度。Bielawski等進(jìn)行了太平洋海岸條斑鱸的RAPD分析。Caccone等對歐洲尖吻鱸的DNA多態(tài)性進(jìn)行RAPD—PCR分析。Garcia等嘗試在斑節(jié)對蝦</p><p>　　RAPD技術(shù)程序簡單快捷，且無需事先確定目的基因的序列，無種屬特異性，有無數(shù)的引物可供利用，能產(chǎn)生足夠的多態(tài)性，無需同位

41、索，可以鑒別物種之間和種群之間的基因組的差異，也可區(qū)分個體之間的差異。為此，許多從事水產(chǎn)育種工作的科研人員已把RAPD技術(shù)應(yīng)用到水產(chǎn)遺傳育種上，并已取得—定的成果。在海水魚類(如大黃魚等)、海水蝦類的種質(zhì)資源研究中，由于同工酶所揭示的種內(nèi)水平上的遺傳差異水平非常低，而RAPD比同工酶更能指示DNA多態(tài)性，因此RAPD分子標(biāo)記在魚類、蝦類、蟹類種質(zhì)資源遺傳學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用前景。目前RAPD分析主要應(yīng)用于標(biāo)記鑒定、遺傳作圖、系統(tǒng)發(fā)育和

42、進(jìn)化及親緣關(guān)系的研究、種群的劃分、群體遺傳多樣性研究等。但在實際應(yīng)用中，RAPD也表現(xiàn)出不足，如顯陽性位點(diǎn)，在后代中不能區(qū)別是純合體還是雜合體；穩(wěn)定性較差；高度的變異性等缺點(diǎn)。當(dāng)然有些是可以避免的，解決的方法是對單鏈引物進(jìn)行篩選，優(yōu)化反應(yīng)條件，但第一個缺點(diǎn)是無法避免的。如能把RAPD與其它分子標(biāo)記如RFLP、AFLP和微衛(wèi)星等結(jié)合使用，RAPD仍將會發(fā)揮更好的用途?？傊S著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和更多應(yīng)用，RAPD技術(shù)也將更加完善，應(yīng)用更

43、</p><p>　　3.2吉富羅非魚雌雄群體遺傳差異的SSR分析</p><p>　　運(yùn)用SSR技術(shù)對吉富羅非魚的雌、雄群體間的分子遺傳結(jié)構(gòu)及其變異進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，雌雄吉富羅非魚群體的多態(tài)性位點(diǎn)比例、PIC、基因多樣性指數(shù)和Shan。non氏指數(shù)的值基本一致，表明國家級廣西南寧羅非魚良種場的P8代吉富羅非魚經(jīng)過多代選育后雌、雄性群體的遺傳差異已經(jīng)很小。董在杰等(2007)利用RAP

44、D技術(shù)對奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚的雌、雄群體間的分子遺傳結(jié)構(gòu)及其變異進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，雌雄奧利亞羅非魚群體的多態(tài)性位點(diǎn)比例、基因多樣性指數(shù)和Shan．non氏指數(shù)的值基本一致，與本研究中的結(jié)論相似。</p><p>　　4、研究進(jìn)展和研究展望</p><p>　　4.1.1種群遺傳多樣性分析和種質(zhì)資源的評估　在海水魚類資源的開發(fā)與保護(hù)中,對魚類種群的種質(zhì)資源進(jìn)行科學(xué)地評估十分重要。利用

45、DNA分子標(biāo)記技術(shù)分析自然種群與人工養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性和不同種屬間或地理群體間的遺傳差異,了解魚類種群關(guān)系、進(jìn)化地位,監(jiān)測魚群遺傳漸滲和評估人工增殖放流效果等,這些都有利于魚類資源的保護(hù)、開發(fā)和利用。</p><p>　　孟憲紅采用RAPD技術(shù)對真鯛野生群體及人工繁殖群體進(jìn)行了DNA多態(tài)性檢測,認(rèn)為真鯛野生群體及人工繁殖群體的遺傳多樣性較為豐富,但人工繁殖群體的遺傳多樣性低于野生群體。王志勇等利用AFLP技術(shù)研

46、究了我國沿海真鯛群體的遺傳變異,結(jié)果顯示:北部灣群體的變異量最低,它與威海群體的遺傳差異顯著,兩者明顯屬于相互獨(dú)立的不同亞種群。 申雪艷等利用RAPD和微衛(wèi)星2種分子標(biāo)記技術(shù)分析了從法國、英國、西班牙引進(jìn)我國的3個大菱鲆群體的遺傳結(jié)構(gòu)。 McConnel S利用微衛(wèi)星技術(shù)研究了加拿大東海5個大西洋鮭群體的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu). Nakabo等利用微衛(wèi)星技術(shù)對東南亞海區(qū)鱸魚進(jìn)行分析,推翻了東亞地區(qū)只有1種鱸魚的說法。 蒙子寧等運(yùn)用RAPD

47、 分析了采自黃海和東海5個海區(qū)的小黃魚的遺傳多樣性,從分子水平上支持了過去有關(guān)學(xué)者把黃海和東海的小黃魚劃分為北、中、南3 個地理群系的觀點(diǎn). Perez2Enriquez等利用微衛(wèi)星3 個DNA 位點(diǎn)分析了包括中國、日本和太平洋西南部8個地點(diǎn)的真鯛( Pag rus m a jor ) 的遺傳差異,證明太平洋北部與西南部的群體遺傳差異明顯。Roques等應(yīng)用微衛(wèi)星D</p><p>　　4.1.2分子系統(tǒng)發(fā)育和親

48、緣關(guān)系的分析　分子系統(tǒng)發(fā)育(Molecular phylogenetics)是指基于分子數(shù)據(jù)尤其是DNA序列來研究有機(jī)體間的進(jìn)化和親緣關(guān)系。物種間親緣關(guān)系的研究為確定育種方案、預(yù)測雜交優(yōu)勢提供了重要的理論依據(jù),近年來,魚類分子系統(tǒng)發(fā)育的研究取得了很大的進(jìn)展。Garrido2Ramos等用具有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的中著絲粒微衛(wèi)星DNA家族序列對鯛科( Sparidae)各屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了分析。 Oakiley等根據(jù)GHC (生長激素

49、內(nèi)含子C)序列分析,認(rèn)為大麻哈魚屬 (O ncorhynchus) 為單系,這與形態(tài)學(xué)和其他分子數(shù)據(jù)(包括核基因和線粒體基因)一致,但不支持被廣泛接受的大麻哈魚屬和大西洋鮭屬(S a lm o) 為姊妹屬的看法,不過,他們認(rèn)為這仍需進(jìn)一步的研究來證實;同時,他們還認(rèn)為基于GHC序列的鮭科魚類的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系是目前所有分子數(shù)據(jù)中最好的。 高天翔等對養(yǎng)殖褐牙鲆( Pa ra lich thys olivaceus) 的線粒體DNACytb

50、基因的部分序列進(jìn)行了測定,認(rèn)為由于褐牙鲆Cytb基因具有高度同源性,因此研究其白化、黑化和正常</p><p>　　4.1.3種類(品種)的鑒定　在魚類育種過程中,準(zhǔn)確地鑒定和篩選具有優(yōu)良遺傳變異的個體是育種工作的前提,但魚類個體標(biāo)志、家系標(biāo)志甚至群體和種類標(biāo)志一直是難以解決的問題,而且有些遺傳變異性是早期無法鑒定和篩選的(如產(chǎn)卵量、品質(zhì)、成熟期等) ,有些變異性狀則需要創(chuàng)造逆境才能知曉,如抗病力、抗逆性等,這些

51、都給魚類遺傳育種帶來了困難。DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展無疑為解決這一難題提供了有力的工具,如果利用這些性狀跟DNA分子標(biāo)記緊密連鎖,不但能夠早期選擇這些性狀,而且還不需創(chuàng)造逆境條件,這不僅可以節(jié)省大量的人力、物力和時間,而且能提高育種的效率。</p><p>　　4.1.4分子標(biāo)記輔助選擇(Ma rke r a s s is ted se le c tio n,簡稱MAS ) 　所謂分子輔助選擇育種技術(shù)就是利用分子

52、標(biāo)記的手段,結(jié)合其他育種手段和方法,選育和培育新品種的育種技術(shù)。 自20世紀(jì)80年代以來, DNA分子標(biāo)記等遺傳標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于遺傳育種領(lǐng)域,形成了多種遺傳方法有機(jī)結(jié)合的有效育種途徑。應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇育種,可以提前預(yù)知選育的結(jié)果,大大提高了選育的效率。一般認(rèn)為,應(yīng)用傳統(tǒng)的選育技術(shù),每代的遺傳獲得量(Genetic gain)通常僅在10% ～15%;而應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)后可明顯提高選育進(jìn)度,特別是對那些傳統(tǒng)表型工具難以度量

53、的性狀的選育,如抗病力、肉質(zhì)、餌料系數(shù)、對溫度和鹽度的耐受能力等,因此,這一育種技術(shù)必將成為21世紀(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物育種的新熱點(diǎn)和新趨勢。</p><p><b>　　5、小結(jié)</b></p><p>　　我國海域廣闊,魚類資源豐富,因此應(yīng)充分利用分子遺傳標(biāo)記的優(yōu)勢,加強(qiáng)對我國主要海水魚類資源的監(jiān)測,主要是跟蹤調(diào)查各種經(jīng)濟(jì)魚類的遺傳多樣性水平、群體遺傳結(jié)構(gòu)、不同種間的親緣

54、與進(jìn)化關(guān)系、不同地理群體的遺傳變異和種源區(qū)的劃分等,同時開展人工繁殖與養(yǎng)殖、人工放流等行為對自然群體遺傳的影響等方面的研究,在分子水平上為海水魚類養(yǎng)殖、資源保護(hù)和遺傳育種等提供依據(jù)。</p><p>　　大多數(shù)魚類的重要經(jīng)濟(jì)性狀,如抗病力、生長速度、肉質(zhì)等都表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳,應(yīng)用傳統(tǒng)的遺傳育種標(biāo)記方法無法確定這些重要性狀是由哪些具體的基因控制的,因此DNA分子標(biāo)記技術(shù)無疑是魚類遺傳育種的有力工具。應(yīng)用DNA分子

55、標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行魚類種質(zhì)資源研究、遺傳結(jié)構(gòu)特征分析、品種鑒定、資源狀況的調(diào)查和評估,將有利于海水魚類資源的保護(hù)、管理和開發(fā);應(yīng)用DNA分子標(biāo)記分析魚類親緣關(guān)系、預(yù)測雜交優(yōu)勢、檢測和評估育種效果、篩選優(yōu)良品種,將有利于海水魚類優(yōu)良品種的選育、培育研究;應(yīng)用DNA分子標(biāo)記分析與重要經(jīng)濟(jì)性狀有關(guān)的連鎖基因,有利于重要經(jīng)濟(jì)性狀基因的篩選、分離與克隆,從而有利于促進(jìn)海水魚類的品系改良和轉(zhuǎn)基因魚的研究。由此可見,應(yīng)用DNA分子標(biāo)記技術(shù)來開展海水魚類遺傳

56、育種是突破傳統(tǒng)育種、有效開發(fā)和保護(hù)海水魚類資源的重要途徑,它將成為海水魚類遺傳學(xué)家和育種學(xué)家討論的熱點(diǎn)問題和研究主流。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　?。?］賈繼光。分子標(biāo)記種質(zhì)資源鑒定和分子標(biāo)記育種［J］。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996，29（4）：1-10。</p><p>　?。?］梁明山，曾宇，等。遺傳標(biāo)記及

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