分子標(biāo)記技術(shù)在甘藍(lán)品種鑒定及未熟抽薹性狀研究中的應(yīng)用.pdf

1、甘藍(lán)起源于地中海沿岸，包括結(jié)球甘藍(lán)、皺葉甘藍(lán)、紅甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、花椰菜、青花菜、抱子甘藍(lán)、球莖甘藍(lán)等多個(gè)變種，現(xiàn)已成為世界許多國家的主要蔬菜。目前，分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種作物研究，但在甘藍(lán)上的應(yīng)用研究剛剛起步，本課題以甘藍(lán)為材料，研究其分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用，主要開展以下三部分工作：第一部分是以結(jié)球甘藍(lán)基因組DNA為模板，優(yōu)化獲得適用于八種甘藍(lán)類蔬菜的RAPD、SRAP、ISSR技術(shù)體系；第二部分是利用SSR、RAPD技術(shù)鑒定甘藍(lán)雜

2、交種“早夏16”、“夏光”的純度，利用SRAP、RAPD技術(shù)鑒定甘藍(lán)雜交種“爭春”、“寒光2號(hào)”的純度，并建立相應(yīng)的指紋圖譜；第三部分是應(yīng)用BSA方法研究春結(jié)球甘藍(lán)未熟抽薹性狀，尋找與春甘藍(lán)未熟抽薹基因連鎖的RAPD標(biāo)記。主要結(jié)論如下： 1.甘藍(lán)RAPD、SRAP、ISSR技術(shù)體系的優(yōu)化和初步應(yīng)用 優(yōu)化得到反應(yīng)總體積為20μl的甘藍(lán)RAPD體系是：25mmol/LMgCl22.0μl+10×PCRBuffer2.0μl+

3、10mmol/LdNTP0.5μl+5U/μlTaqE0.5μl+20ng/μlPrimer1.5μl+10ng/μl模板DNA3μl+滅菌雙蒸水10.5μl。適宜的RAPD擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5min;94℃1min，37℃1min，72℃1.5min(40cycles)；72℃10min。 優(yōu)化得到反應(yīng)總體積為20μl的SRAP反應(yīng)體系是：25mmol/LMgCl22.0μl+10×PCRBuffer2.0μ1+10mmol/

4、ldNTP0.4μl+5U/μlTaqE0.2μl+30ng正向Primer+30ng反向Primer+25ng模板DNA，其余體積以滅菌雙蒸水補(bǔ)齊。適宜的SRAP擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4℃5min;94℃1min，35℃1min，72℃1.5min(5cycles)；94℃1min，48℃1min，72℃1.5min(35cycles)；72℃10min。 優(yōu)化得到反應(yīng)總體積為20μl的ISSR反應(yīng)體系是：25mmol/LMgCl2

5、1.8μl+10×PCRBuffer2.0μl+10mmol/LdNTP0.4μl+5U/μlTaqE0.3μl+30ngPrimer+30ng模板DNA，其余體積以滅菌雙蒸水補(bǔ)齊。適宜的ISSR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5min;94℃1min，50℃1min，72℃1.5min(40cycles)；72℃10min。 經(jīng)優(yōu)化的RAPD、SRAP、ISSR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序?qū)Π朔N甘藍(lán)類蔬菜均適用，并且可分別利用RAPD引物S18、SR

6、AP引物組合M3-E5和M4-E5、ISSR引物844將八種甘藍(lán)類蔬菜一一區(qū)分。 2.分子標(biāo)記方法鑒定甘藍(lán)雜交種純度 以“夏光”、“早夏16”、“爭春”、“寒光2號(hào)”四雜交種及其各自親本的基因組DNA為模板組合，通過RAPD方法成功篩選出能鑒定各雜交種純度的引物，其中能鑒定雜交種夏光的引物為S15、S42和S147，能鑒定雜交種早夏16的引物為S42、S78和S88，能鑒定雜交種爭春的引物為S42、S103和S193，能

7、鑒定雜交種寒光的引物為S42、S89、S151，并將引物S42對(duì)四組材料擴(kuò)增出的特異的RAPD指紋圖譜轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的數(shù)字指紋。 3.春結(jié)球甘藍(lán)未熟抽薹性狀RAPD分子標(biāo)記研究 經(jīng)260個(gè)RAPD引物篩選，獲得4個(gè)能擴(kuò)增出甘藍(lán)未熟抽薹基因連鎖標(biāo)記的候選引物，4個(gè)引物對(duì)F2代分離群體擴(kuò)增產(chǎn)生5個(gè)連鎖標(biāo)記，單個(gè)標(biāo)記的連鎖距離不同，其中最近達(dá)8.58cM。選擇遺傳距離較近的三個(gè)標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)三標(biāo)記的大小和引物來源將其分別命名為