小G蛋白R(shí)ab6和Ran在對(duì)蝦和果蠅細(xì)胞吞噬及抗病毒中的作用.pdf

1、細(xì)胞吞噬是宿主消化病原的直接途徑，是生物體最古老、最基本的防衛(wèi)機(jī)制之一，它是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。無論是單細(xì)胞動(dòng)物還是多細(xì)胞動(dòng)物，都是通過吞噬活動(dòng)保持自身穩(wěn)定和對(duì)外防御。吞噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，肌動(dòng)蛋白（actin）在空間聚合上的變化為細(xì)胞吞噬提供了動(dòng)力，肌動(dòng)蛋白骨架的變化影響吞噬的整個(gè)過程。肌動(dòng)蛋白高度有序的聚合，依靠其他因子的調(diào)控，目前只發(fā)現(xiàn)小G蛋白R(shí)ho可以影響骨架蛋白聚合。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，小G蛋白R(shí)an和Rab6可以通

2、過調(diào)節(jié)骨架蛋白進(jìn)而調(diào)控吞噬，但是具體機(jī)制不清楚。在前期研究基礎(chǔ)上，本論文進(jìn)一步研究Rab6和Ran調(diào)控細(xì)胞吞噬及其抗病毒的分子機(jī)理。
　　 由于對(duì)蝦沒有細(xì)胞系，所以在體內(nèi)研究目的蛋白的過量表達(dá)比較困難。質(zhì)粒轉(zhuǎn)入對(duì)蝦活體，除了具有導(dǎo)入質(zhì)粒的困難，質(zhì)粒本身啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、mRNA的結(jié)構(gòu)都會(huì)影響蛋白的表達(dá)。體外合成mRNA，不僅成本較高，而且mRNA及其不穩(wěn)定，容易降解。為了找到一種合適的對(duì)蝦體內(nèi)蛋白過量表達(dá)的方法，我們采

3、取體外重組表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)，純化透析后注射進(jìn)入對(duì)蝦體內(nèi)。結(jié)果顯示，GFP能有效進(jìn)入對(duì)蝦血細(xì)胞內(nèi)，分布于細(xì)胞質(zhì)中。該方法的建立為研究對(duì)蝦及其病毒的蛋白質(zhì)的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 本文研究結(jié)果顯示，在對(duì)蝦中，Rab6蛋白通過和肌動(dòng)蛋白直接互作，影響肌動(dòng)蛋白骨架的構(gòu)象，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞吞噬，抵抗對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)的侵染。在對(duì)蝦中，當(dāng)Rab6基因的表達(dá)被序列特異的siRNA抑制后，肌動(dòng)蛋白的構(gòu)象發(fā)生明顯變化，細(xì)胞骨架蛋

4、白actin由片層狀變成偽足狀，并且細(xì)胞吞噬病毒的活性顯著下降，吞噬病毒的速率降低，表明Rab6蛋白通過影響actin蛋白的構(gòu)象調(diào)控細(xì)胞吞噬。本文采用果蠅S2細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Rab6蛋白對(duì)細(xì)胞吞噬的調(diào)控機(jī)制與對(duì)蝦中的結(jié)果相同。結(jié)果表明，在S2細(xì)胞中，當(dāng)Rab6基因被序列特異的siRNA抑制表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白的聚合程度明顯下降;Rab6基因過表達(dá)后，肌動(dòng)蛋白聚合程度提高;在S2細(xì)胞中拯救Rab6基因表達(dá)時(shí)，細(xì)胞骨架形態(tài)也恢復(fù)正常。上

5、述結(jié)果說明，Rab6蛋白對(duì)肌動(dòng)蛋白的聚合起非常重要的作用。有效的吞噬包括顆粒攝取和吞噬體的成熟過程，吞噬過程可分為趨化、吸附、吞入和消化殺菌四個(gè)階段。為了探討Rab6調(diào)控吞噬的具體階段，在果蠅S2細(xì)胞中，我們將Rab6蛋白和早期溶酶體標(biāo)志蛋白(Rab5)、晚期溶酶體標(biāo)志蛋白（LAMP）相比較，發(fā)現(xiàn)Rab6影響整個(gè)吞噬過程。結(jié)果表明，無論是顆粒攝取還是消化處理時(shí)期，無論是吞噬前期還是吞噬后期，Rab6基因被抑制后，細(xì)胞吞噬百分率及酸化百分

6、率都顯著下降。結(jié)果證明，Rab6影響肌動(dòng)蛋白的構(gòu)像，從而調(diào)控細(xì)胞吞噬的整個(gè)過程。將對(duì)蝦的Rab6序列進(jìn)行同源比較，結(jié)果顯示對(duì)蝦的Rab6和果蠅、人類的Rab6分別具有88％和91％的同源性，且在結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)上很保守，說明在進(jìn)化中，無論是脊椎動(dòng)物還是無脊椎動(dòng)物，Rab6基因很保守。因此，本文揭示的Rab6調(diào)控?zé)o脊椎動(dòng)物細(xì)胞吞噬的機(jī)制在動(dòng)物界中可能是普遍存在的一條簡(jiǎn)單高效的吞噬調(diào)控方式，這為研究先天性免疫分子機(jī)制在脊椎動(dòng)物中擴(kuò)大了視野，我

7、們的研究為小G蛋白調(diào)控吞噬提供了新證據(jù)。
　　 廣泛的證據(jù)表明病毒的結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染中起重要作用，但是關(guān)于宿主和病毒之間的蛋白互作研究很少。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，WSSV病毒的VP466蛋白和宿主的Rab6蛋白、原肌球蛋白(tropomyosin)、肌動(dòng)蛋白形成蛋白復(fù)合體。本文進(jìn)一步研究揭示VP466是雙功能蛋白，可以介導(dǎo)兩條信號(hào)通路，一條是VP466通過與tropomyosin的互作有利于病毒復(fù)制，一條是宿主Rab6蛋白

8、與VP466互作后有利于宿主抗病毒免疫，且兩條通路最后的效應(yīng)蛋白都是肌動(dòng)蛋白。在VP466-Rab6-actin信號(hào)通路中，VP466是Rab6的GTPase激活蛋白，Rab6活性的提高導(dǎo)致actin聚合的加強(qiáng)，有利于細(xì)胞吞噬活性的增強(qiáng)。在VP466-tropomyosin-actin信號(hào)通路中，原肌球蛋白引導(dǎo)肌動(dòng)蛋白變化，actin被病毒利用，有利于病毒自身的感染和裝配。研究結(jié)果表明，宿主Rab6蛋白和原肌球蛋白都結(jié)合在VP466上的

9、同一個(gè)區(qū)域(301-340)，所以WSSV病毒VP466蛋白介導(dǎo)的兩條通路實(shí)際上是一種競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。越來越多的證據(jù)表明多功能蛋白存在于病原中，但是病毒中的多功能蛋白很少見。因此，我們的研究揭示了病毒多功能蛋白的存在，并且病毒蛋白可以競(jìng)爭(zhēng)性被病毒本身或宿主利用，啟動(dòng)兩條不同的通路，闡述了一種關(guān)于無脊椎動(dòng)物病毒與宿主之間互作的新機(jī)制。
　　 Ran蛋白之前在對(duì)蝦體內(nèi)發(fā)現(xiàn)調(diào)控吞噬，但是具體過程不清楚。為了闡明其調(diào)控機(jī)理，我們以無脊椎動(dòng)物模

10、式生物果蠅S2細(xì)胞為研究對(duì)象，開展相關(guān)研究。本文研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅S2細(xì)胞吞噬其病毒DCV過程中，Ran基因上調(diào)表達(dá)，暗示Ran蛋白可能參與果蠅抗病毒感染的先天性免疫。結(jié)果表明，當(dāng)Ran基因表達(dá)被抑制時(shí)，細(xì)胞的吞噬活性顯著下降;當(dāng)Ran基因過表達(dá)時(shí)，細(xì)胞的吞噬活性明顯上升。當(dāng)吞噬標(biāo)志性蛋白R(shí)ab5、LAMP和Ran基因表達(dá)被抑制后，無論在吞噬攝取顆粒時(shí)期還是消化處理時(shí)期，抑制Ran表達(dá)的細(xì)胞其吞噬百分率一直最低。以上結(jié)果表明，Ran蛋白參