棉花幼苗鹽脅迫條件下Solexa轉錄組測序結果的分析及驗證.pdf

1、鹽脅迫是全世界范圍內(nèi)影響作物產(chǎn)量的最嚴重的非生物脅迫之一，利用基因工程提高植物的耐鹽性，培育出適合在鹽漬化土地上生長的植物品種是有效利用鹽漬化土地的主要方法。棉花是一種生物學研究中常用的模式植物，鹽脅迫會嚴重影響棉花的生長和產(chǎn)量，尤其是在種子萌發(fā)和幼苗生長階段。棉花耐鹽的生理機制已經(jīng)得到廣泛的研究，具體機理包括離子的平衡、滲透調節(jié)物質的積累以及抗氧化劑的積累。但是棉花耐鹽的分子機理研究較少，因此，深入研究棉花鹽響應機理有助于利用基因工程

2、手段提高棉花的耐鹽性。
　　 本實驗通過Solexa高通量測序的方法，對鹽脅迫處理前后的棉花幼苗進行轉錄組測序，通過分析大量的測序結果，發(fā)現(xiàn)了相當多受鹽脅迫處理上調和下調的基因，揭示了棉花幼苗鹽處理前后轉錄組水平的復雜的調控網(wǎng)絡。之后，利用qRT-PCR的方法對測序結果進行了驗證。并對NaCl處理后，上調非常明顯的4個編碼LEA蛋白的基因進行表達模式的分析、基因的分離、系統(tǒng)發(fā)生分析和功能驗證。主要實驗結果和結論如下：
　　

3、 （1）對照和鹽處理兩個Solexa測序樣品分別檢測到3 583 646和3 694 330個具有信號的探針，各包含了395 874和389 356個特異性標簽。通過排除假陽性標簽，余下的清晰標簽分別為145 794和138 518個。通過對照棉花基因表達的數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站，分別找到了75 500（51.8％）和72 077（52.0％）個匹配的標簽。我們以log2值（變化倍數(shù)）>2和<-2、P-value值（統(tǒng)計學有效值）<0.001、F

4、DR（錯誤發(fā)生率）<0.01作為篩選基因的標準，找到了223個上調基因和317個下調的基因。其中，未知基因約占45％。參與不同信號通路的基因都發(fā)生了不同程度的上調和下調，表明它們在植物適應鹽脅迫的過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。
　　 （2）利用RT-PCR的方法檢測了22個基因的相對表達量，結果與測序結果基本一致，表明轉錄組測序結果是可靠的。
　　 （3）利用qRT-PCR的方法檢測了4個LEA基因和3個已知的非測序結果篩

5、選得到的LEA基因的相對表達量，結果顯示,4個LEA基因受鹽脅迫誘導上調的倍數(shù)要明顯高于其它3個LEA基因，表明這4個LEA基因在棉花耐受鹽脅迫過程中發(fā)揮著主要作用。4個LEA基因的組織表達模式結果顯示，M19406受NaCl誘導的表達量顯著高于TA24166_3635和X15086，且三者在真葉和根中的誘導表達模式一致；但M19379在真葉中幾乎檢測不到它的表達，而在根中受鹽誘導表達顯著。
　　 （4）我們通過RACE的方法分

6、離得到4個LEA基因的全長序列。利用ClustalX等生物學軟件，對4個棉花、18個擬南芥和14個水稻的LEA蛋白基因進行系統(tǒng)發(fā)生分析。結果顯示，不同LEA蛋白組別之間差異較大，棉花的4個LEA基因M19379、M19406、TA24166_3635、X15086分別從屬于dehydrin、PvLEA18、LEA_2、LEA_4四個不同的組別。
　　 （5）在酵母中表達M19379、M19406、TA24166_3635、X15