鹽脅迫條件下水稻幼苗microRNA的克隆與研究初探.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是生物體內(nèi)一類調(diào)控蛋白基因表達(dá)的小分子RNA，對(duì)于生物的生長發(fā)育具有重要的意義。要研究miRNA的具體結(jié)構(gòu)和功能，首先要通過克隆方式獲得miRNA。目前植物miRNA的克隆主要是針對(duì)模式植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)，水稻(Oryza sativa)進(jìn)行的。水稻是重要的糧食作物，其全基因組基因測(cè)序工作已經(jīng)完成，有利于對(duì)基因的結(jié)構(gòu)域工作的分析。本實(shí)驗(yàn)以水稻為主要實(shí)驗(yàn)材料，在優(yōu)化植物R

2、NA提取技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步完善植物small RNA的提取和純化方法；然后在這些工作的基礎(chǔ)上克隆鹽脅迫水稻幼苗的miRNAs。結(jié)果如下： 1．針對(duì)不同的植物RNA提取具有不同要求的情況，以富含多糖多酚類物質(zhì)的麻瘋樹幼葉為材料，在現(xiàn)有植物 RNA提取方法的基礎(chǔ)上利用皂土對(duì)多糖多酚物質(zhì)具有吸附能力的特性，用之于植物RNA的提取。RNA電泳分析、純度鑒定及RT-PCR結(jié)果顯示：該種方法提取的RNA質(zhì)量好，純度高，能應(yīng)用于后繼實(shí)驗(yàn)。并

3、且與傳統(tǒng)RNA提取方法相比，該方法具有操作簡便，耗時(shí)短的特點(diǎn)，對(duì)富含多糖多酚類物質(zhì)的材料尤為有效。 2．以玉米(Zea mak,L.)幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行現(xiàn)有的RNA提取方法改進(jìn)，以適應(yīng)小分子RNA的提取。根據(jù)Mg<'2+>能有效沉淀小分子核酸的特性，使用Mg<'2+>代替?zhèn)鹘y(tǒng)的Li<'+>，Na<'+>，NH<'4+>，K<'+>等沉淀離子進(jìn)行沉淀，而且為了得到最佳實(shí)驗(yàn)效果，對(duì)Mg<'2+>濃度、沉淀時(shí)間與溫度以及離心時(shí)間等

4、參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示：最佳的分離small RNA的條件是：用100μm/ml MgCl<,2>加2.5倍體積的無水乙醇于-20℃沉淀2h，并在2℃，13000 rpm離心30 min。電泳分析及純度檢測(cè)結(jié)果顯示：在該條件下提取的RNA完整性好，純度高，1g新鮮玉米幼苗可以得到1.54μg small RNA，比參照方法高出約11％。并且操作簡單，耗時(shí)較少。 3．對(duì)水稻幼苗進(jìn)行鹽脅迫，將其作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行miRNAs的克隆。在

5、克隆的過程中，首先對(duì)RNA的提取方法做了進(jìn)一步的改進(jìn)，除了用Mg<'2+>作為沉淀離子之外，在最終沉淀之前先使用了高鹽濃度下50％的PEG8000對(duì)smallRNAs進(jìn)行富集，電泳及RNA純度分析顯示：該改進(jìn)方法具有明顯的smallRNAs富集能力，并且所提取的RNAs純度高，質(zhì)量好。 4．將已經(jīng)提取的水稻RNA進(jìn)行small RNAs的回收和純化，加Poly(A)、cDNA合成、加Poly(G)及PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收

6、后再與載體T-Vector連接，并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。盡管重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率低，未達(dá)到建立基因文庫的要求，但是菌落PCR能擴(kuò)增出一定的預(yù)期片段，而且質(zhì)粒電泳結(jié)果也顯示部分轉(zhuǎn)化子有片段插入。雙酶切操作未能獲得預(yù)期片段，估計(jì)是由于預(yù)期片段太短，用瓊脂糖電泳不能有效檢測(cè)。因此，預(yù)期片段是否真正插入到轉(zhuǎn)化子中還有待進(jìn)一步的檢測(cè)。 整個(gè)克隆鹽脅迫條件下水稻幼苗miRNAs的實(shí)驗(yàn)雖然由于時(shí)間不足而沒有取得最終的結(jié)果，但是取得了階段性成功