斷奶仔豬大腸桿菌F18菌株抗性候選基因的篩選與功能分析.pdf

1、斷奶仔豬腹瀉和水腫病是規(guī)模豬場危害最為嚴(yán)重的疾病之一，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是造成斷奶仔豬腹瀉的主要病原菌，產(chǎn)Vero細(xì)胞毒素大腸桿菌(Verotoxigenic Escherichia coli，VTEC)則與仔豬水腫病密切相關(guān)。國外學(xué)者前期研究表明，α-(1，2)巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因1(FUT1)與E.coli F18受體基因相連鎖，可以作為控制E.coli F18

2、粘附的候選基因。FUT1基因M307處存在G/A突變位點，并且G對A為顯性，即AA基因型豬對E.coli F18表現(xiàn)為抗性，GG型和AG型表現(xiàn)為敏感性，并據(jù)此在國外豬種中實現(xiàn)了抗病育種。然而，在國內(nèi)地方豬種中均未檢測到FUT1基因M307 AA和AG基因型個體，全部為GG基因型，呈極端偏態(tài)分布，由此可見，中外豬種在抗E.coliF18感染過程中具有不同的遺傳機(jī)理。
　　課題組在前期研究中利用在蘇太豬群體中檢測到的少量FUT1基因A

3、G型個體進(jìn)行適當(dāng)選種選配，通過多年選育，已在蘇太豬中建立了大腸桿菌病抗性(AA型)和敏感性(AG和GG型)資源家系群體。此外，課題組還構(gòu)建了基于表達(dá)E.coli F18黏附素的V型分泌系統(tǒng)，并結(jié)合受體黏附試驗技術(shù)，對資源家系群體E.coli F18抗性/易感性進(jìn)行進(jìn)一步的分析和驗證。本研究基于建立的蘇太豬E.coli F18抵抗性（AA型）和敏感性（AG和GG型）資源家系，利用基因表達(dá)譜芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等相關(guān)技術(shù)對豬E.coli F18

4、抗性候選基因進(jìn)行了分析和篩選，以期揭示中國地方豬種抗E.coli F18的遺傳基礎(chǔ)，解決國內(nèi)地方豬種E.coli F18抗性育種的關(guān)鍵科學(xué)問題。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.運用表達(dá)譜芯片篩選大腸桿菌F18敏感型和抗性型兩對比組間差異基因。
　　(1)以Fold change絕對值大于2倍作為差異標(biāo)準(zhǔn)，在敏感型（GG基因型）對抗性型(AA基因型)配對組中，差異基因共13個，其中上調(diào)6個，下調(diào)7個;在另外敏感型(AG

5、基因型）對抗性型(AA基因型)配對組中，共篩選出差異基因6個，其中上調(diào)4個，下調(diào)2個。
　　(2)經(jīng)GO分析可知，上述差異表達(dá)的基因涉及免疫應(yīng)答、胞外區(qū)修飾（如糖基化）、細(xì)胞黏附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、代謝等多個方面。通過KEGG數(shù)據(jù)庫查詢敏感型對抗性型差異基因所在通路以及文獻(xiàn)挖掘，確定了與受體形成相關(guān)的鞘糖脂生物合成—球系列通路和炎癥免疫通路對F18大腸桿菌病抗性具有調(diào)控作用，并將其作為下一步研究的重點。。
　　(3)差異基

6、因SLA-1、SLA-3、 ST3GAL1、A基因，以及FUT1、TAP1和SLA-DQA基因通過熒光定量驗證后與表達(dá)譜芯片結(jié)果一致，說明芯片結(jié)果可靠。
　　2，對芯片結(jié)果炎癥免疫通路中兩個差異基因SLA-1與SLA-3在E.coli F18抗性組和敏感性組間進(jìn)行表達(dá)比較及分析。
　　(1)運用3個內(nèi)參基因?qū)LA-1與SLA-3基因表達(dá)水平進(jìn)行均一化。組織表達(dá)譜結(jié)果表明，SLA-1與SLA-3基因在11個組織中均表達(dá);SL

7、A-1在肺、免疫器官如脾、胸腺、淋巴結(jié)以及消化器官胃、十二指腸、空腸中的表達(dá)量相對較高;SLA-3基因在肺和淋巴結(jié)中的表達(dá)量較高，在心、肝、脾、肺、胃、肌肉、胸腺、十二指腸和空腸中的表達(dá)量較低。
　　(2) SLA-1與SLA-3基因在E.coli F18抗性組大部分組織，如脾、肺、胃、胸腺、淋巴結(jié)、十二指腸和空腸中的表達(dá)量相對較高，但是與敏感性組之間的表達(dá)差異不顯著。
　　(3)線性相關(guān)關(guān)系分析顯示，SLA-1與SLA-3

8、基因在E.coli F18抗性組脾、肺、胃、胸腺、淋巴結(jié)、十二指腸和空腸等表達(dá)較高組織中的表達(dá)量呈現(xiàn)弱的正相關(guān)。而在E.coli F18敏感組，SLA-1與SLA-3基因在組織淋巴結(jié)中的表達(dá)量呈現(xiàn)弱的負(fù)相關(guān);在組織胃、胸腺、十二指腸和空腸中呈現(xiàn)強(qiáng)烈的正相關(guān)，在組織脾和肺中呈現(xiàn)弱的正相關(guān)。
　　(4)經(jīng)GO和Pathway功能分析顯示，SLA-1與SLA-3基因均參與了37個生物學(xué)過程，主要涉及抗原遞呈和免疫應(yīng)答的調(diào)控，并涉及9個通

9、路，其中5個通路與免疫功能相關(guān)。
　　3，對芯片結(jié)果中鞘糖脂生物合成—球系列通路中所有基因在個體不同組織中的表達(dá)，尤其針對腸道組織進(jìn)行全面的分析。
　　(1)組織表達(dá)譜結(jié)果顯示，F(xiàn)UT1、FUT2、ST3GAL1、HEXA、HEXB、B3GALNT1和NAGA7個基因在所檢測的11個組織中均表達(dá)，總體來看，所有基因在肝、肺、腎、胃中表達(dá)量較高，其次為十二指腸和空腸，在脾、胸腺和淋巴結(jié)等免疫組織中的表達(dá)量較低，在心和肌肉中的表

10、達(dá)量最低。
　　(2)7個通路基因在E.coliF18抗性組和敏感組個體十二指腸和空腸組織之間表達(dá)進(jìn)行比較顯示，在十二指腸中，F(xiàn)UT1和NAGA基因在E.coli F18抗性型個體的平均表達(dá)量高于敏感型個體;其余5個基因則在E.coli F18敏感性組中的表達(dá)量相對較高，差異倍數(shù)達(dá)2倍以上的有ST3GAL1基因。在空腸組織中僅FUT1基因在E.coli F18抗性型組中的表達(dá)量高于敏感組;其余6個基因均在敏感組中的表達(dá)量較高，差異

11、倍數(shù)達(dá)2倍以上的有FUT2、HEXA和NAGA基因。
　　(3)7個通路基因在蘇太豬E.coli F18抗性個體十二指腸組織和空腸組織相關(guān)性分析表明，在蘇太豬E.coli F18抗性個體十二指腸組織中，F(xiàn)UT1基因與HEXA、HEXB和NAGA基因，F(xiàn)UT2基因與ST3GAL1基因，ST3GAL1基因與HEXA、HEXB和B3GALNT1基因之間均表現(xiàn)為弱的負(fù)相關(guān);其余基因之間均表現(xiàn)為弱的正相關(guān)。在蘇太豬E.coli F18抗性個

12、體空腸組織中，F(xiàn)UT1基因與ST3GAL1、HEXA和NAGA基因，F(xiàn)UT2基因與ST3GAL1基因，ST3GAL1基因與HEXA、HEXB和B3GALNT1基因之間均呈現(xiàn)弱的負(fù)相關(guān)，其余基因之間均表現(xiàn)為弱的正相關(guān)。
　　(4)7個通路基因在蘇太豬E.coli F18敏感性個體十二指腸組織和空腸組織相關(guān)性分析表明，在蘇太豬E.coli F18敏感性個體十二指腸組織中，NAGA與另外6個基因FUT1、FUT2、ST3GAL1、HEX

13、A、HEXB以及B3GALNT1均呈現(xiàn)弱的負(fù)相關(guān);另外，F(xiàn)UT1基因與FUT2、HEXB、B3GALNT1呈弱的負(fù)相關(guān)。除FUT2與B3GALNT1兩基因間呈顯著正相關(guān)外(P＜0.05），其余基因之間均呈現(xiàn)弱的正相關(guān)。通路基因在蘇太豬E.coli F18敏感性個體空腸組織中，NAGA基因僅與FUT1、FUT2基因呈現(xiàn)弱的負(fù)相關(guān)。其中，F(xiàn)UT1與FUT2、HEXB，F(xiàn)UT2與HEXB、B3GALNT1，HEXB與B3GALNT1間均表現(xiàn)為

14、顯著正相關(guān)。
　　4，運用差異蛋白質(zhì)組學(xué)篩選大腸桿菌F18菌株敏感型和抗性型兩對比組間差異蛋白。
　　(1)在E.coli F18敏感型和對抗性型配對組中，發(fā)現(xiàn)20個蛋白點在表達(dá)量上有顯著變化，其中10個點在E.coli F18抗性組中高表達(dá)，10個點在E.coli F18敏感組中高表達(dá)。
　　(2)對兩組之間呈現(xiàn)的20個差異蛋白質(zhì)進(jìn)行ESI-MS/MS分析，成功對16個蛋白斑點進(jìn)行了肽指紋圖譜的測定，共確定為12種蛋

15、白質(zhì)，其中2287、2589和2484，2074、1967和1912斑點分別呈現(xiàn)同一種蛋白，即actin，alpha2(ACTA2)和albumin(ALB)。另外10個有意義的差異蛋白分別為在E.coli F18抗性組中上調(diào)的Transferrin(TF)、similar to collapsinresponse mediator protein-2A(LOC100151886)、ribosomal protein SA(RPSA)和

16、similartoAGAP005293-PA(LOC100153507)4種蛋白，以及在E.coli F18敏感組中上調(diào)的vinculin(VCL)、aconitase2(ACO2)、acti,alpha, cardiac muscle1(ACTC1)、actin beta(ACTB)、heat shock protein27kDa(HSP27)和smooth muscle protein22-alpha(SM22A)6種蛋白。

17、　　(3)對差異蛋白進(jìn)行GO分析可知，在已知功能的基因中，顯著性功能包括了肌肉收縮、細(xì)胞表面蛋白定位、胞外刺激應(yīng)答、激活MAPKK等多個方面。通過KEGG數(shù)據(jù)庫查詢差異蛋白對應(yīng)基因的所在通路，結(jié)果中包括有肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控、黏著連接、白血球經(jīng)內(nèi)皮遷移、黏著斑等。
　　(4)基于KEGG數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有信息，結(jié)合所有顯著性Pathway中所屬的蛋白，構(gòu)建了差異蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。由于本實驗結(jié)果獲得的差異蛋白數(shù)量較少，以及數(shù)據(jù)庫中信息