miRNAs對斷奶仔豬大腸桿菌抗性的調(diào)控作用及機(jī)制分析.pdf

1、斷奶仔豬腹瀉和水腫病是導(dǎo)致斷奶仔豬死亡的重要傳染性疾病，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，E.coliF18菌株是引起這兩種疾病的主要病原菌。由于中國地方豬種抗E.coliF18分子機(jī)制尚不清楚，本研究從microRNA及其靶基因的調(diào)控作用入手，首先基于課題組前期在蘇太豬（具有太湖豬和杜洛克血統(tǒng)的培育品種）F18大腸桿菌抗性型和敏感型個體microRNA測序篩選出的重要的microRNA—miR-192，利用靶基因預(yù)測、qPCR、雙熒光素酶

2、報告檢測、細(xì)胞水平的細(xì)菌感染刺激、TALEN敲除以及microRNA前體SNP檢測等一系列基因功能驗證技術(shù)，系統(tǒng)分析miR-192及其靶基因的作用，以期進(jìn)一步揭示microRNAs在斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性的調(diào)控機(jī)制。主要試驗結(jié)果如下:
　　(1)一種高效準(zhǔn)確的大腸桿菌對腸上皮細(xì)胞黏附水平的檢測方法有助于大腸桿菌抗性相關(guān)miRNA及其靶基因的功能研究，本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR方法，以大腸桿菌F18ab、F18ac和K88ac

3、菌毛蛋白基因和豬β-ACTIN基因設(shè)計定量PCR引物，以大腸桿菌和豬腸上皮細(xì)胞系(IPEC-J2)總DNA為模板進(jìn)行相對定量PCR檢測，利用2-ΔΔct計算不同細(xì)胞培養(yǎng)面積孔板中細(xì)菌相對細(xì)胞黏附數(shù)量。結(jié)果顯示，6孔板、12孔板和24孔板培養(yǎng)面積的豬腸上皮細(xì)胞分別對F18ab、F18ac和K88ac大腸桿菌的相對黏附數(shù)量均差異不顯著，大腸桿菌相對黏附數(shù)量不受細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)量的影響，結(jié)果表明所建立的方法能夠準(zhǔn)確檢測大腸桿菌相對黏附數(shù)量，為本研究

4、中大腸桿菌黏附相關(guān)實驗提供了便捷可靠的檢測方法。
　　(2)miR-192靶基因的生物信息分析結(jié)合前期表達(dá)譜芯片結(jié)果，獲得5個重要的靶基因，分別是DLG5、ALCAM、 FRMD4B、MIPOL1和ZFHX3，結(jié)合基因生物學(xué)功能和文獻(xiàn)挖掘的結(jié)果，將ALCAM和DLG5基因確定為關(guān)鍵靶基因進(jìn)行相關(guān)功能研究。通過構(gòu)建關(guān)鍵靶基因非編碼區(qū)的熒光素酶報告重組載體，與miRNA模擬物(mimics)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在細(xì)胞水平分析驗證miR-

5、192對于關(guān)鍵靶基因的靶向作用，熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，miR-192 mimics對ALCAM和DLG5基因均表現(xiàn)為抑制作用(P＜0.05)。
　　(3)關(guān)鍵靶基因ALCAM和DLG5的表達(dá)譜分析結(jié)果表明，DLG5基因在蘇太豬35日齡斷奶仔豬抗性型和敏感型個體的空腸、十二指腸、肝臟、肺、腎等組織中高度表達(dá)，抗性型個體的相對表達(dá)量高于敏感型個體，且在心臟和淋巴組織中達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，在所有組織中抗性型和敏感型個體表達(dá)

6、水平的差異倍數(shù)為1.049～6.464; ALCAM基因在蘇太豬的肝臟、肺、腎組織中高度表達(dá)，在胃、淋巴、十二指腸和空腸組織中度表達(dá)，在其他組織中表達(dá)量相對較低，且抗性型和敏感型個體各組織組間差異均不顯著。在蘇太豬從初生到斷奶不同發(fā)育時期（8日齡、18日齡、28日齡和35日齡）的表達(dá)差異分析結(jié)果表明，DLG5基因在肌肉、肺臟及免疫（胸腺、淋巴和脾臟）等組織中隨日齡增加表達(dá)降低，十二指腸和空腸組織中在28日齡的表達(dá)量降至最低，35日齡時呈

7、上升趨勢。ALCAM基因28日齡腎臟組織中表達(dá)量顯著高于8日齡(P＜0.05);28日齡和35日齡十二指腸組織的表達(dá)量顯著低于18日齡，呈下調(diào)趨勢(P＜0.05)。
　　(4)在豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2中分析F18ab、F18ac和K88ac侵襲對miR-192及其關(guān)鍵靶基因表達(dá)的影響，細(xì)菌刺激未對miR-192的轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生顯著影響，細(xì)菌培養(yǎng)上清刺激也沒有引起miR-192轉(zhuǎn)錄水平的顯著變化，且不隨刺激時間表現(xiàn)出變化趨勢;

8、細(xì)菌刺激引起了DLG5和ALCAM基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)(P＜0.05)，細(xì)菌培養(yǎng)上清刺激也能引起DLG5和ALCAM基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，且隨著刺激時間的延長，DLG5和ALCAM基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)呈顯著下調(diào)趨勢(P＜0.05)。
　　(5)利用TALEN載體介導(dǎo)敲除IPEC-J2細(xì)胞miR-192成熟體，獲得miR-192成熟體序列缺失的細(xì)胞株，對細(xì)胞株中重要靶基因表達(dá)水平的檢測結(jié)果表明，miR-192敲除細(xì)胞和對照組的DLG5、A

9、LCAM、FRMD4B的表達(dá)水平差異不顯著，而MIPOL1和ZFHX3在敲除細(xì)胞中的表達(dá)水平表現(xiàn)為顯著下調(diào)(P＜0.05)，大腸桿菌黏附水平檢測結(jié)果顯示，miR-192敲除細(xì)胞對大腸桿菌F18ab、F18ac和K88ac的黏附能力均表現(xiàn)為顯著上升(P＜0.05)。
　　鑒于蘇太豬同時具有外來品種和中國地方豬品種的遺傳基礎(chǔ)，關(guān)于蘇太豬microRNAs的研究并不能完全代表和揭示中國地方豬品種斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性的調(diào)控機(jī)制。因此

10、，本研究又以中國地方豬品種梅山豬為研究對象，利用E.coli F18菌株對梅山斷奶仔豬進(jìn)行大腸桿菌感染試驗，并通過細(xì)菌數(shù)量檢測、小腸上皮細(xì)胞體外黏附及病理檢測等一系列試驗對大腸桿菌感染試驗的表型結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)的驗證，獲得了確證的E.coli F18抗性型和敏感型個體，然后利用Selex高通量測序，篩選梅山豬斷奶仔豬抗性型和敏感型個體間差異microRNAs，通過靶基因預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)互作圖構(gòu)建等生物信息學(xué)手段，結(jié)合課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選

11、出重要的靶基因及其調(diào)控通路，同時利用RNAi技術(shù)和細(xì)菌感染在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗證重要靶基因及其通路基因?qū)Υ竽c桿菌感染的調(diào)控作用，探討中國地方斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性相關(guān)的microRNA分子及其關(guān)鍵靶基因的功能及其調(diào)控機(jī)制。主要試驗結(jié)果如下:
　　(1)對蘇太豬中發(fā)揮重要調(diào)控作用的miR-192在梅山豬中進(jìn)行初步的功能分析驗證，組織表達(dá)譜結(jié)果顯示，miR-192在十二指腸和空腸組織中均具有較高水平的表達(dá)，肝和腎中度表達(dá)，在心、脾

12、、肺、胃、肌肉、胸腺和淋巴中表達(dá)量較低。結(jié)合前期梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌試驗的結(jié)果，大腸桿菌處理沒有造成十二指腸和空腸組織中miR-192表達(dá)水平的顯著性變化，miR-192可能并沒有在梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌感染過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　(2)利用前期通過大腸桿菌感染試驗和一系列驗證獲得的確證的梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌抗性型和敏感型全同胞個體，對其十二指腸組織進(jìn)行microRNA高通量測序分析，獲得梅山豬抗性型和敏感型全同胞個體

13、差異miRNAs24個，其中上調(diào)15個，下調(diào)9個;通過qPCR方法檢測驗證miRNAs的差異倍數(shù)，發(fā)現(xiàn)其與高通量篩選結(jié)果具有較高的一致性;結(jié)合課題組前期梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌抗性型和敏感型全同胞個體的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果以及差異miRNAs的實驗驗證結(jié)果，并通過靶基因互作網(wǎng)絡(luò)的分析，將miR-7136-5p及其靶基因MyD88基因確定為關(guān)鍵microRNA和關(guān)鍵靶基因，鑒于MyD88是TLRs/IL-1R信號通路中重要的接頭蛋白，將其所在TLR4

14、信號通路作為本試驗重點(diǎn)研究的關(guān)鍵調(diào)控通路，分析其在大腸桿菌感染中的作用及其機(jī)制。
　　(3)F18ac和K88ac菌體刺激后，豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2的MyD88轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，其所在的TLR4通路中TNFα基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào)(P＜0.01)。細(xì)菌培養(yǎng)液上清刺激后，MyD88基因在8小時后急劇下調(diào)，TNFα基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P＜0.05)。受大腸桿菌F18ac和K88ac刺激后，PK15細(xì)胞的MyD88同樣顯著下調(diào)

15、(P＜0.05);F18ac使TLR4通路中CD14基因的表達(dá)極顯著上調(diào)(P＜0.01)，而K88ac的刺激未顯著改變其表達(dá);IFN-α表達(dá)變化不顯著，K88ac刺激使TLR4通路中IL-1β和TLR4基因輕度上調(diào)，TNF-α基因水平極顯著上調(diào)(P＜0.01)。細(xì)菌培養(yǎng)上清液同樣使PK15細(xì)胞MyD88基因整體表現(xiàn)下調(diào);CD14基因整體為下調(diào);IFN-α表現(xiàn)為下調(diào);IL-1β和TLR4基因整體趨勢為上調(diào);F18ac上清處理組TNF-α表

16、現(xiàn)為極顯著水平的上調(diào)(P＜0.01)，而K88ac上清處理組TNF-α未表現(xiàn)出上調(diào)趨勢。
　　(4)利用RNAi技術(shù)獲得干擾豬MyD88基因效率最高的shRNA表達(dá)載體，將其包裝成慢病毒載體，用于建立MyD88基因穩(wěn)定沉默的細(xì)胞系，最終獲得MyD88基因的干擾效率分別為69.3％、61.0％的IPEC-J2和PK15細(xì)胞。MyD88基因的下調(diào)造成PK15細(xì)胞TLR4和IL-1β基因表達(dá)水平顯著下調(diào)(P＜0.05)，而CD14、IF

17、N-α和TNF-α基因表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化。RNAi MyD88基因未對細(xì)胞培養(yǎng)液上清中細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的水平造成顯著影響。
　　本研究結(jié)果表明，microRNA在蘇太豬和梅山豬斷奶仔豬大腸桿菌感染過程中均發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，而且進(jìn)一步提示梅山豬（中國地方豬品種）和蘇太豬（含有外來豬品種血統(tǒng)的培育品種）在大腸桿菌病抗性的遺傳基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制方面確實存在差異。miR-192靶向作用DLG5和ALCAM基因在蘇太豬斷奶