紅球菌P14降解類固醇激素及其相關(guān)基因的初步研究.pdf

1、在眾多的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物中,類固醇激素的干擾活性最強(qiáng),并且難以降解可以長期存在環(huán)境中,對人類健康造成極大危害因而受到社會的廣泛關(guān)注。微生物降解是去除類固醇激素污染的一種非常有效方法。本論文以類固醇激素為研究對象,選擇實驗室前期分離的一株具有浮起至油層的性質(zhì)且能降解多環(huán)芳烴的海洋菌Rhodococcussp.P14為研究菌株,基于全基因組測序的生物信息學(xué)分析結(jié)果,主要研究菌株對類固醇激素降解能力、降解的中間代謝產(chǎn)物檢測及降解相關(guān)的功能基因

2、的表達(dá)驗證,探討菌株降解類固醇激素的機(jī)制。本文研究的主要結(jié)果如下:
　　紅球菌P14對100μg/mL卡那霉素不敏感;對100μg/mL羧芐青霉素、50μg/mL四環(huán)素、100μg/mL氨芐青霉素、170μg/mL氯霉素、50μg/mL鏈霉素敏感。菌株能夠在0％到5.5%的鹽濃度范圍內(nèi)都能夠生長,說明該菌的耐鹽范圍很廣,適應(yīng)性強(qiáng)。
　　菌株P(guān)14能夠在以50mg/L的T和AD為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長,不能夠在以50mg

3、/L的E1、E2、E3、EE2、ADD、P為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長,說明P14能夠利用類固醇激素T和AD為碳源進(jìn)行生長。不添加其它碳源條件下檢測對50mg/L的E1、E2、E3、EE2在7天內(nèi)的降解情況。實驗表明:菌株P(guān)14能夠降解E3和T且降解能力較高在第七天的降解率分別為95.7%和69.97%;菌株P(guān)14能夠降解E2但是降解能力不高約35%;菌株P(guān)14在7天內(nèi)都不能降解E1、EE2。添加其它碳源的情況下測P14降解不同濃度的

4、10mg/L、50mg/L、100mg/L的E2、T和EE2實驗表明菌株P(guān)14能夠內(nèi)幾乎完全降解10mg/L、50mg/L、100mg/L的E2和T,不能降解EE2。
　　利用GC-MS檢測菌株P(guān)14在降解E2和T過程中的代謝產(chǎn)物,檢測到E2的代謝產(chǎn)物E1和T的代謝產(chǎn)物雄甾-4烯-3.17二酮(Androst-4-ene-3,17-dione,AD)、雄甾-1、4二烯-3.17二酮(Androsta-1,4-diene-3,17-

5、dione,ADD)和17羥基-17甲基-雄甾-1、4二烯-3酮(17-hydroxy-17-methyl-androsta-1,4-dien-3-one)。根據(jù)檢測到的代謝產(chǎn)物,結(jié)合P14降解實驗、全基因組信息和相關(guān)文獻(xiàn),推測P14降解E2可能途徑有兩種:第一種為E2降解為E1然后再轉(zhuǎn)化為E3進(jìn)一步降解,第二種為E2直接轉(zhuǎn)化為E3進(jìn)一步降解;推測P14降解T可能途徑為T降解為AD,再進(jìn)一步降解為ADD,或者T甲基化后,再脫氫轉(zhuǎn)化為17

6、-hydroxy-17-methyl-androsta-1,4-dien-3-one,再進(jìn)一步降解,最后進(jìn)入轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水。
　　根據(jù)紅球菌P14全基因組測序精細(xì)圖,對其進(jìn)行基因功能注釋發(fā)現(xiàn):該菌具有類固醇激素降解相關(guān)的基因如ketosteroid-9α-hydroxylase(KSH)、3-ketosteroid-Δ1-hydrogenase(KSTD)、3α-hydroxy steroid dehydrogenase(3α

7、-HSD)和3β-hydroxy steroid dehydrogenase(3β-HSD)等。運用全基因測序預(yù)測的基因全序列信息設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,構(gòu)建了4個重組菌株分別為E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-446Ksh、E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-459Ksd、E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-4229Ksh和E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-2

8、126Hsd,SDS-PAGE和Western Blotting驗證構(gòu)建重組菌異源表達(dá)成功。
　　重組菌E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-4229Ksh和E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-2126Hsd在1mMIPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)10小時后降解50mg/L的E2的降解率達(dá)到35.34%和17.79%,重組菌E.coliBL21(DE3)-pET-32a(+)-446Ksh和E.coliBL21(