條石鯛促性腺激素基因的克隆、表達(dá)和性類固醇激素分析.pdf

1、本文以人工培育的條石鯛（Oplegnathus fasciatus）為研究對象，運(yùn)用組織學(xué)、同源性克隆和RACE克隆法、放射免疫測定（RIA）法等技術(shù)手段，對條石鯛卵巢各發(fā)育期特征、促性腺激素（Gonadotropin Hormone, GtH）和膜孕激素受體（membrane progestin receptor，mPRα） cDNA全長的克隆、在組織表達(dá)特性和卵巢發(fā)育不同時期的表達(dá)特性、血清中促性腺激素在繁殖周期中的變化規(guī)律等進(jìn)行了

2、研究，為深入認(rèn)識條石鯛生殖調(diào)控機(jī)制提供了理論支撐。本研究結(jié)果為全面揭示條石鯛生殖調(diào)控機(jī)制以及繁殖調(diào)控研究提供了豐富的基礎(chǔ)資料。相關(guān)結(jié)果如下：
　　1.條石鯛促性腺激素α（GtHα）亞基的克隆及其表達(dá)特性分析
　　采用同源性克隆和cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）方法，從條石鯛(Oplegnathidae fasciatus)垂體中獲得了全長為897bp的GtHα cDNA序列，其中包含249bp的5’非編碼區(qū)、399bp的開放

3、閱讀框和249bp的3’非編碼區(qū)。其ORF編碼132個氨基酸，前38個氨基酸為信號肽。肽鏈中包括10個保守Cys殘基和2個N-糖基化位點(diǎn)，在第122和124Cys中間間隔了一個組氨酸（His），形成CXC型趨化因子的特征結(jié)構(gòu)。此外，在3’端末端含有一個加尾信號 ATTAAA。其預(yù)測蛋白分子量為14.59KDa，預(yù)測等電點(diǎn)為8.41。氨基酸同源性和進(jìn)化分析表明，條石鯛GtHα與鱸形目魚類的進(jìn)化關(guān)系較近，與鱸魚的同源性最高為98％。實時熒光

4、定量PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，GtHα mRNA在腦、垂體、卵巢中的表達(dá)量較高，在心、肝臟、胃、腸、肌肉、幽門盲囊微量表達(dá)，在脾臟、頭腎、鰓、腎臟中不表達(dá)，其中在垂體中的表達(dá)量最高；周期表達(dá)表明，垂體中 GtHα mRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達(dá)到最大值，卵巢中 GtHα mRNA在卵巢發(fā)育的Ⅳ期達(dá)到最大值，而腦組織中 GtHαmRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達(dá)到最低值。
　　2.條石鯛促濾泡激素β（FSHβ）亞基的克隆及其表達(dá)特性分析
　　采

5、用同源性克隆和RACE方法從條石鯛(Oplegnathidae fasciatus)垂體中獲得了全長為554bp的FSHβ cDNA序列。其中開放閱讀框長363bp，編碼了含120個氨基酸的蛋白，其中前18個氨基酸為信號肽。肽鏈中含了12個保守的Cys殘基和一個N-糖基化位點(diǎn)（NIS），在第255和第257半胱氨酸中間間隔了一個谷氨酸，形成CXC型趨化因子的特征結(jié)構(gòu)。此外，在3’端含有一個加尾信號AAATAA。其預(yù)測蛋白分子量為12.9

6、6KDa，預(yù)測等電點(diǎn)為6.05。氨基酸同源性和進(jìn)化分析表明，條石鯛FSHβ與鱸形目魚類的進(jìn)化關(guān)系較近，與花鱸的同源性最高為88%。實時熒光定量PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ mRNA在垂體、卵巢中的表達(dá)量較高，在腦、心、肝臟、脾臟、鰓、胃、腸、肌肉、幽門盲囊微量表達(dá)，在頭腎和腎臟中不表達(dá)，其中在垂體中的表達(dá)量最高；周期表達(dá)表明，垂體中FSHβ mRNA在卵巢發(fā)育的Ⅳ期達(dá)到最大值，而卵巢和腦組織中FSHβmRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達(dá)到最低值。

7、
　　3.條石鯛促黃體激素β（LHβ）亞基的克隆及其表達(dá)特性分析
　　采用同源性克隆和RACE方法克隆了條石鯛(Oplegnathidae fasciatus) LHβcDNA序列，并分析了LHβmRNA在雌性條石鯛組織中的表達(dá)差異和卵巢發(fā)育不同時期卵巢、垂體、腦中表達(dá)水平變化。結(jié)果表明，條石鯛LHβ基因全長857bp，其中ORF為450bp，編碼了149個氨基酸，前24個氨基酸為信號肽，肽鏈中包含了12個保守的Cys殘基和

8、一個N-糖基化位點(diǎn)（NQT），在第4個Cys和第5個半Cys位點(diǎn)之間存在著硬骨魚類特異性的Cys-Ser-Gly-His（CSGH）區(qū)域。此外，在3’端含有一個加尾信號AATAAA。其預(yù)測的蛋白分子量為16.56KDa，理論等電點(diǎn)為5.52。氨基酸同源性和進(jìn)化分析表明，條石鯛LHβ與鱸形目魚類的進(jìn)化關(guān)系較近，與斜帶石斑魚的同源性最高為98%。
　　實時熒光定量PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，LHβmRNA在垂體和卵巢中的表達(dá)量較高，在鰓、心臟

9、、脾臟、腎臟、肝臟、腦、胃、腸、肌肉、幽門盲囊微量表達(dá)，在頭腎中不表達(dá)，其中在垂體中的表達(dá)量最高；周期表達(dá)表明，垂體和卵巢中 LHβ mRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達(dá)到最大值，而腦組織中LHβmRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達(dá)到最低值。
　　4.條石鯛膜孕激素受體（mPRα）的克隆及其表達(dá)特性分析
　　采用同源性克隆和RACE方法，從條石鯛(Oplegnathidae fasciatus)卵巢中獲得全長為1222bp的mPRα序列。其中開

10、放閱讀框為1060bp，編碼了含353個氨基酸的蛋白。前16個氨基酸為信號肽。成熟肽部分包含了13個保守的Cys殘基。其蛋白分子量為40.68KDa，理論等電點(diǎn)為7.08。氨基酸序列比較分析發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)中存在7個跨膜區(qū)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，條石鯛mPRα與云紋犬牙石首魚的同源性最高為98%。實時熒光定量PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)mPRαmRNA在腦和卵巢中的表達(dá)量較高，腎臟、鰓、心臟、脾臟、、幽門盲囊、腎臟、肝臟、腦、胃、腸、肌肉中表達(dá)量較低，其

11、中在腦中的表達(dá)量最高。周期表達(dá)表明，垂體和腦中的mPRα mRNA在卵巢發(fā)育的Ⅳ期達(dá)到最大值，而卵巢中的mPRαmRNA在卵巢發(fā)育的Ⅴ期達(dá)到最大值。
　　5.血清中促性腺激素在條石鯛卵巢發(fā)育不同時期的含量測定
　　利用125I標(biāo)記的放射免疫測定（RIA）方法檢測了FSH和LH在條石鯛在卵巢發(fā)育不同時期血清中的含量變化。結(jié)果表明： FSH在在卵黃生成期時急劇上升，并達(dá)到最大值，在產(chǎn)卵期時其含量有所下降。LH在卵黃生成期時急劇上