鵝脂肪性狀相關(guān)基因的克隆表達(dá)及LEPR在脂肪細(xì)胞中的功能研究.pdf

1、leptin receptor(LEPR)基因在調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡、脂肪貯存中發(fā)揮重要功能，Adipose triglyceride lipase(ATGL)和Lipoprotein lipase(LPL)是機(jī)體脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，參與脂肪細(xì)胞的分化過程，Toll-like receptor4(TLR4)和Interleukin-6(IL-6)是機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白因子，在由肥胖所引起的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究在克隆鵝LEPR、A

2、TGL、LPL、TLR4和IL-6基因的cDNA序列的基礎(chǔ)上，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究了各基因在鵝脂肪組織中的表達(dá)分布、以及在填肥后的表達(dá)差異情況，用RNA干擾(RNAi)技術(shù)研究了LEPR基因?qū)Z脂肪細(xì)胞中分化、代謝、免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控作用，進(jìn)一步研究了羅格列酮(Rosiglitazone)和GW-9662對(duì)脂肪細(xì)胞中基因表達(dá)的影響，分析LEPR對(duì)脂肪細(xì)胞基因的表達(dá)調(diào)控與Peroxisome proliferators-

3、activated receptorgamma(PPARγ)通路間的可能關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.LEPR、ATGL、LPL、TLR4和IL-6基因cDNA序列的獲得與分析
　　 利用RT-PCR方法和RACE技術(shù)，克隆得到鵝LEPR基因全長(zhǎng)cDNA序列，以及鵝ATGL，LPL，TLR4和IL-6基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)(coding sequence，CDS)序列。結(jié)果表明，鵝LEPR基因全長(zhǎng)cDNA序列4，370b

4、p(GenBank登錄號(hào)為HQ699480)，其中包括628bp的5’UTR(untranslated region，UTR)、3，468bp的編碼區(qū)(coding region，CDS)和239bp的3’UTR。翻譯編碼1，156個(gè)氨基酸，與鴨的同源性達(dá)到90％以上，與雞、火雞的同源性達(dá)到75％以上，與人等哺乳動(dòng)物的同源性少于50％。
　　 本實(shí)驗(yàn)所獲得的鵝ATGL基因cDNA序列有1，462bp(GenBank登錄號(hào)為HQ9

5、14789)，其中包括14bp的5’UTR、1，446bp的編碼區(qū)。翻譯編碼482個(gè)氨基酸，與鴨的同源性達(dá)到90％，與雞的同源性達(dá)到86％，與其他鳥類的同源性均達(dá)到85％以上。
　　 本實(shí)驗(yàn)中獲得的鵝LPL基因cDNA序列有1，765bp(GenBank登錄號(hào)為JF343526)，其中包括1，482bp的編碼區(qū)和283bp的3’UTR。翻譯編碼494個(gè)氨基酸，與鴨的同源性達(dá)到97％，與雞的同源性達(dá)到94％，與麻雀的同源性達(dá)到92

6、％。
　　 本實(shí)驗(yàn)中獲得的鵝TLR4基因cDNA序列有2，641bp(GenBank登錄號(hào)為HQ436371)，其中包括79bp的5’UTR，2，532bp的編碼區(qū)和30bp的3’UTR。翻譯編碼843個(gè)氨基酸，與雞和麻雀的同源性達(dá)到70％以上，與人等哺乳動(dòng)物的同源性小于50％。
　　 本實(shí)驗(yàn)中獲得的鵝IL-6基因cDNA序列有802bp(GenBank登錄號(hào)為JF437643)，其中包括70bp的5’UTR，705bp

7、的編碼區(qū)和27bp的3’UTR。翻譯編碼234個(gè)氨基酸，與雞的同源性達(dá)到74％，與人的同源性只有39％。
　　 2.鵝LEPR，ATGL，LPL，TLR4，IL-6基因表達(dá)的組織特異性研究
　　 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法研究了LEPR、ATGL、LPL、TLR4和IL-6基因在鵝體內(nèi)表達(dá)的組織特異性，以及各基因在填肥鵝和對(duì)照鵝間的表達(dá)差異。組織表達(dá)特異性結(jié)果表明，鵝LEPR較高表達(dá)于腦、肝、骨骼肌、肺和腹脂中，在小腸中的

8、表達(dá)量最低；ATGL基因在皮下脂肪的表達(dá)量較高，在胃和肺中的表達(dá)量較低；LPL基因在心臟、腹脂、骨骼肌中表達(dá)量較高，在脾臟中的表達(dá)量較低；TLR4基因較高表達(dá)于肝臟中，在皮下脂肪和肺中表達(dá)量較低；IL-6基因在肝臟中的表達(dá)量顯著高于其他組織，在腦和小腸中表達(dá)量較低。
　　 填肥鵝與對(duì)照鵝間差異表達(dá)結(jié)果顯示，經(jīng)填肥后，LEPR基因在皮下脂肪、腎臟和小腸中的表達(dá)量顯著升高；ATGL基因在皮下脂肪中的表達(dá)量顯著下降，在腹脂和肺中的表達(dá)

9、量升高；LPL基因在腹脂、肝臟和小腸中的表達(dá)量顯著升高，而在心臟中的表達(dá)量顯著下降；TLR4基因在皮下脂肪和小腸中的表達(dá)量顯著升高，在心臟中的表達(dá)量顯著降低；IL-6基因在皮下脂肪、胃、小腸和腦中的表達(dá)量顯著升高。各基因在填肥后的表達(dá)變化揭示其在鵝的脂肪代謝過程中可能發(fā)揮重要作用。
　　 3.鵝LEPR對(duì)脂肪細(xì)胞分化、代謝相關(guān)功能基因的表達(dá)調(diào)控研究
　　 通過鵝前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)，利用RNAi技術(shù)研究了LEPR基因?qū)χ?/p>

10、肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)影響。研究結(jié)果表明：鵝脂肪細(xì)胞分化過程，各基因(LEPR、ATGL、LPL、TLR4和IL-6)的mRNA表達(dá)水平隨著細(xì)胞分化而逐漸升高，鵝ATGL基因在第6天表達(dá)量較高，后期表達(dá)量逐漸下降，LEPR、LPL和TLR4基因均在第8天表達(dá)量最高，到第10天表達(dá)量下降，而IL-6基因在第4天表達(dá)量較高，第6天時(shí)下降，到第10天表達(dá)量達(dá)到最高；油酸可以促進(jìn)鵝前體脂肪細(xì)胞的分化，500μM的作用效果最明顯，其作用不同時(shí)間對(duì)L

11、EPR、LPL、FAS(fatty acid synthase)、PPARγ(peroxisome proliferators-activated receptor)、Adiponectin基因的表達(dá)水平起到不同程度的促進(jìn)作用，但抑制了ATGL基因的表達(dá)；篩選出了LEPR基因有效的siRNA(LS1)，經(jīng)干擾條件優(yōu)化后，干擾效果可達(dá)到60％以上；轉(zhuǎn)染LEPR-siRNA干擾LEPR基因表達(dá)后，顯著降低了FAS、PPARγ、ATGL基因的

12、表達(dá)水平，而Adiponectin基因的表達(dá)顯著升高；LEPR基因被干擾后，各基因?qū)τ退岬拿舾行远疾煌潭鹊亟档?。上述結(jié)果顯示，油酸可以促進(jìn)鵝脂肪細(xì)胞的分化，而LEPR基因在這一過程中可能發(fā)揮了重要的功能。
　　 4.鵝LEPR對(duì)脂肪細(xì)胞中免疫相關(guān)基TLR4和IL-6的表達(dá)調(diào)控研究
　　 通過鵝前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)，利用RNAi技術(shù)研究了LEPR基因?qū)χ局忻庖呦嚓P(guān)基因的表達(dá)影響。研究結(jié)果表明：不同濃度的油酸和E.col

13、i脂多糖(LPS)對(duì)鵝脂肪細(xì)胞中TLR4和IL-6基因的表達(dá)有調(diào)控作用，用500μM的油酸和20ng/ml的LPS處理鵝脂肪細(xì)胞，均可提高TLR4基因和IL-6基因的表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染LEPR-siRNA干擾LEPR基因表達(dá)后，對(duì)TLR4和IL-6基因的表達(dá)影響不顯著；LEPR基因被干擾后，各基因?qū)τ退岷蚅PS的敏感性都不同程度地降低。上述結(jié)果顯示，油酸和LPS可以促進(jìn)鵝脂肪細(xì)胞TLR4和IL-6基因的表達(dá)，LEPR對(duì)TLR4和IL-6基因

14、的表達(dá)調(diào)控作用不明顯，但其可能在油酸/LPS誘發(fā)的免疫信號(hào)通路中發(fā)揮了重要作用。
　　 5.羅格列酮(ROS)和GW-9662對(duì)鵝脂肪細(xì)胞中基因的表達(dá)調(diào)控研究
　　 通過鵝前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)，研究PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮和抑制劑GW-9662對(duì)脂肪細(xì)胞中基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明用不同濃度的羅格列酮處理脂肪細(xì)胞后，不同程度地促進(jìn)了LEPR、LPL、ATGL、PPARγ、FAS和Adiponectin基因的表達(dá)，對(duì)TLR4

15、和IL-6基因的表達(dá)起到了不同程度的抑制作用；用不同濃度的GW-9662處理鵝脂肪細(xì)胞后，對(duì)本實(shí)驗(yàn)所研究的8個(gè)基因的表達(dá)均起到了不同程度的抑制作用；與對(duì)照組脂肪細(xì)胞相比，LEPR基因干擾組的細(xì)胞用ROS處理顯著降低了PPARγ、ATGL、FAS和LPL基因的表達(dá)量，Adiponectin的表達(dá)水平顯著提高，TLR4和IL-6基因的表達(dá)變化不顯著；與對(duì)照組脂肪細(xì)胞相比，LEPR基因干擾組的細(xì)胞用GW-9662處理顯著降低了PPARγ、FA