SQR9微生物有機(jī)肥防治黃瓜枯萎病的效應(yīng)與機(jī)制研究.pdf

1、黃瓜枯萎病是一種土傳病害，由致病性的尖孢鐮刀菌黃瓜?；鏔usarium.oxysporum f sp.cucumerinum J．H.Owen(FOC)引起，發(fā)病嚴(yán)重時田間病株率達(dá)50％以上，已成為困擾設(shè)施農(nóng)業(yè)的重要病害．目前防治此類病害主要用化學(xué)農(nóng)藥，但化學(xué)農(nóng)藥的防治易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題，所以采用安全、高效、環(huán)境友好型生物防治成為有前景的另一選擇。單純使用菌株制劑抑制土傳病害的效果往往有限，利用優(yōu)質(zhì)有機(jī)肥做載體，復(fù)合幾種拮

2、抗菌二次發(fā)酵后生產(chǎn)的微生物有機(jī)肥料，對連作障礙中枯萎病的生防效果較好．本文從拮抗菌的篩選鑒定、抗菌物質(zhì)的分離提純、定殖情況、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、土壤微生物區(qū)系的變化等方面對微生物有機(jī)肥防治黃瓜枯萎病進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究．
　　 采用傳統(tǒng)的形態(tài)，生理生化特性分析和分子生物學(xué)的方法對篩選的拮抗細(xì)菌SQR9進(jìn)行了鑒定，確定其為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）．平板對崎實驗表明菌株SQR9對黃瓜枯萎病致病菌尖孢鐮刀菌

3、的生長有抑制作用，以菌株SQR9的基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增得到11個與脂肽抗生素surfactin,fengycin，iturin,bacillomyein,subfilosin，subtilisin的合成相關(guān)的基因，菌株SQR9的發(fā)酵液進(jìn)行酸沉淀、甲醇抽提后的粗提液稀釋2倍，對尖孢鐮刀茵茵絲的生長抑制率為54.9%，稀釋l倍和未經(jīng)稀釋的粗提液，使黃瓜枯萎病病原茵孢子萌發(fā)率分別比對照降低了70.1%、83.6%．粗提液對多種土傳病原

4、茵有強(qiáng)烈的抑制作用．HPLC-ESI-MS分析表明，粗提液中檢測出質(zhì)荷比(M+H)+為1063.6、1017.5、1031.6、1045.6、1059.6以及1506.0、1435.0、1449.9、1463.9、1492.9,1477.9的兩組物質(zhì)，分別為bacillomycin和fengycin的同系物．
　　 將拮抗菌SQR9與Trichoderma harzianum SQR T-037接種于合適的有機(jī)肥(OF)載體中，

5、進(jìn)行二次固體發(fā)酵，獲得了3種分別含SQR9(BIO A)、含SQR T-037( BIOB)、含SQR9和SQR T-037( BIO AB)的微生物有機(jī)肥，盆栽試驗采用營養(yǎng)缽育苗和盆缽中同時添加肥料的方法，比較了有機(jī)肥與3種微生物有機(jī)肥防治黃瓜枯萎病的效果差異．結(jié)果表明，黃瓜移栽后60 d，3種生物有機(jī)肥處理的植株的地上部生物量提高了1.9-2.3倍，根系生物量平均提高了2.1倍，株高平均增加了72.7%．有機(jī)肥對黃瓜生長的促進(jìn)作用不

6、及微生物有機(jī)肥。對照黃瓜枯萎病的發(fā)病率最高(73%)，BIOAB處理的發(fā)病率最低，僅為15%．施用有機(jī)肥處理的黃瓜發(fā)病率比對照降低了43.2%。
　　 采用Komada選擇性培養(yǎng)基對根際土壤尖孢鐮刀菌計數(shù)表明，黃瓜移栽后第60天，對照根際土的病原菌數(shù)量顯著高于其它處理，達(dá)1.48x105 CFU·g-1（根鮮重）.單施有機(jī)肥的黃瓜根際土的病原菌降低了84.6%，BIO AB處理的黃瓜根際土內(nèi)的病原菌數(shù)量最低（1.2x103 CF

7、U．g-1（根鮮重））．用尖孢鐮刀菌黃瓜轉(zhuǎn)化型的特異引物擴(kuò)增其基因組的一段DNA片段，對F.oxysporum數(shù)量進(jìn)行Real-time PCR定量結(jié)果可知，各處理根際土的DNA拷貝數(shù)在3.4x105-1.32x107 copy.g-1（根鮮重）之間，定量PCR的計數(shù)與傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)基計數(shù)法所得到的結(jié)果呈現(xiàn)相同的規(guī)律，即施用微生物有機(jī)肥處理的根際土待測DNA拷貝數(shù)比對照顯著降低，3種微生物有機(jī)肥處理的黃瓜根際土壤的病原菌DNA片段的拷

8、貝數(shù)比對照低2個數(shù)量級．采用枯草芽孢桿菌選擇性培養(yǎng)基在未接種的對照(CK)、有機(jī)肥(OF)、生物有機(jī)肥B(BIO B)處理的黃瓜根際土中沒有分離出符合SQR9特征的菌落，而在BIOA和BIO AB處理的植株根際能分別回收到6.03x104、1.62x104 CFU'g-1（根鮮重）的sQR9．用哈茨木霉的專用引物進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增結(jié)果看來，未接種處理的土壤哈茨木霉數(shù)量為102-103copy.g-1（根鮮重），BIO B和BIOAB處理

9、的木霉增殖至4.9-5.0 log copy.g-1（根鮮重），表明B.subtilis SQR9和Tharzianum SQR-T037已經(jīng)在根際土成功定殖，因而能有效地阻止病原菌的入侵，盆栽試驗還發(fā)現(xiàn)，待黃瓜植株枯萎病開始發(fā)病時（移栽后30 d），施用有機(jī)肥和生物有機(jī)肥處理的黃瓜葉片內(nèi)的MDA含量比對照顯著降低，生物有機(jī)肥處理的黃瓜過氧化氫酶(CAT)比對照提高了35.4-59.0%，過氧化物酶(POD)活性比對照提高了46.1-8

10、6.8%，超氧化物酶(SOD)活性平均提高了33.3%，苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性提高了71.2-109.3%;微生物有機(jī)肥的施用還提高了黃瓜葉片中β-1，3．葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的活性，兩者比對照分別平均提高了58.5-86.5%、52.1-71.4%．定殖實驗中，通過電轉(zhuǎn)化的方法成功獲得了具GFP標(biāo)記和卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子SQR9-gfp,菌株SQR9-gfp可以通過蘸根的方法在自然土壤中成功定殖，其在黃瓜根表的定殖數(shù)量最多（106

11、-107 CFU.g-1根），其次為根際土壤、根內(nèi)，土體土中數(shù)量最少。菌體在根表和根際土的定殖有利于其在根表形成“防御層”抵御病原菌的侵染。主要定殖部位為主根伸長區(qū)和根毛區(qū)、主根與側(cè)根的分岔處，根尖部分定殖很少，這可能是因為這些部位根系分泌物的組成與濃度有關(guān)，也表明菌體可能是在根形成后遷移過去的，而不是隨根尖生長點擴(kuò)散的．
　　 對BIO AB，OF和CK3個土壤樣品細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行454高通量測序，結(jié)果表明3個土壤樣品

12、的細(xì)菌群落構(gòu)成相似，均以厚壁菌門（Firmicutes）含量最多、其次為變形菌門（Proteobactcria）、再次為放線菌門(Actinobacteria)．但不同處理間某些菌群數(shù)量有差異，樣品BIO AB和OF中芽孢桿菌綱內(nèi)的屬含量最高的3個屬都依次是acillaceae．Paenibacillaceae和Planococcaceae，而對照樣品土壤中芽孢桿菌綱內(nèi)的屬含量最高的3個屬翻艮次是Bacillaceae、Paenibac

13、illaceae和Clostridiaceae．BIO AB和OF中Bacillaceae的含量分別達(dá)37.82%和43.55%，而對照樣品中Bacillaceae的含量則僅有20.51%．在屬水平上，有機(jī)肥和生物有機(jī)機(jī)肥中Bacillu、Methylocystaceae、Paenibacillus、Actinomadura和Actinoalloteichus屬為優(yōu)勢菌，而對照土壤樣品中的優(yōu)勢菌則為Bacillus，Asticcacau