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1、酚氧化酶原(proPO)是對蝦類體液免疫的特異性因子之一,在對蝦免疫過程中具有十分重要的作用,建立proPO的體外表達系統(tǒng)對于深入研究對蝦proPO參與免疫的過程及作用具重要意義。 本研究將斑節(jié)對蝦proPO基因克隆進原核表達載體pET-28a(+),在大腸桿菌中表達,SDS-PAGE和Western blot顯示在78.5 kDa附近有一條特異性條帶。采用低溫誘導(dǎo)表達后可直接檢測到酚氧化酶(PO)的活性,對表達后形成的包涵體進
2、行變復(fù)性處理后也可檢測到PO的活性。 將proPO基因克隆進昆蟲細(xì)胞表達載體pIZT/V5-His,轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾(Sf 9)細(xì)胞,在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光。經(jīng)過Zeocin<'TM>抗生素篩選后,轉(zhuǎn)基因細(xì)胞陽性率約在70%以上。用PCR可在細(xì)胞中檢測到相應(yīng)的GFP和proPO序列;SDS-PAGE檢測可在Sf9細(xì)胞中可以檢測到一條分子量約為67 kDa的特異性條帶,并且具有PO的酶活性,顯示proPO在Sf9細(xì)胞中得到成
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