蚯蚓蛋白酶解工藝與氨基酸螯合鹽的制備及生物效應(yīng)研究.pdf_第1頁
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1、蚯蚓蛋白資源化利用,已由原單方向的飼料化利用轉(zhuǎn)向了多功能產(chǎn)品的開發(fā)利用。氨基酸螯合金屬鹽的制備是涉及到氨基酸的制備,螯合物的合成及后期產(chǎn)物生物效應(yīng)檢測(cè)(bioassay)的系統(tǒng)工作,螯合鹽在微量元素肥料、液體肥料、動(dòng)物飼料添加劑、種子包衣劑生產(chǎn)中的運(yùn)用相當(dāng)廣泛。 本研究利用蚯蚓蛋白作為氨基酸供體,對(duì)比了蚯蚓自溶和添加外源蛋白酶水解產(chǎn)率的變化,并引入響應(yīng)面(RSM)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解條件,篩選出螯合銅、鋅鹽的最佳螯合條件,最后通過生物檢

2、測(cè),即小麥發(fā)芽率試驗(yàn)和小麥種芽敏感性試驗(yàn),檢驗(yàn)FeSO4,EDTA-Fe,AA-Fe三種鐵鹽的生物效應(yīng),評(píng)價(jià)了三種鐵鹽的對(duì)小麥種芽相關(guān)部位和功能體的靶位作用。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下: 1.整個(gè)水解過程中酸性蛋白酶處理的氨基態(tài)氮濃度都明顯高于自溶處理,差異顯著,從3h到8h時(shí),加酶處理水解度由12.7%提高到22%,自溶處理水解度由6.62%提高到16.05%,同時(shí)酸性蛋白酶相對(duì)于自溶處理的水解度提高率由91.8%下降到37.1%

3、。 2.水解時(shí)間X和氨基態(tài)氮濃度Y進(jìn)行擬合,酸性蛋白酶處理與自溶處理方程分別為:Y=0.432×exp(0.130X);Y=0.260×exp(0.143X),模型的相關(guān)系數(shù)分別為0.9383*,0.9928*。自溶模型擬合度低于加酶處理模型,蚯蚓自溶過程是一個(gè)不穩(wěn)定的反應(yīng)過程。 3.生產(chǎn)工藝中原材料的保存方式對(duì)后期酶解工藝的影響甚為重要,4℃和25℃條件保存及放置時(shí)間對(duì)后期蚯蚓自溶工藝的水解率產(chǎn)生了顯著的影響,4℃存放

4、蚯蚓勻漿物在相同放置時(shí)間內(nèi)水解率均大于25℃的水解率,兩者差異顯著。4℃條件下存放有利于后期酶解流程中水解率的提高,存放時(shí)間不宜超過4h。 4.編碼值溫度(A)、酶濃度(B)、酶解時(shí)間(C)的響應(yīng)面分析試驗(yàn),利用DesignExpert7.1回歸分析,得到水解率預(yù)測(cè)值(Y)對(duì)編碼自變量A,B,C的回歸方程為:Y=22.86+1.66A+1.83B+0.92C+1.23AB-0.70AC-0.55BC+1.58A2+0.2482-

5、0.5C2,系數(shù)顯著性檢驗(yàn)后模型修正:Y=22.86+1.66A+1.83B+1.58A2,模型中A,B,C求偏導(dǎo),得出最佳條件:溫度=50℃,酶濃度=5%,酶解時(shí)間=4.34h。 5.銅螯合的最佳條件:溫度40℃,時(shí)間30min,質(zhì)量比2:1;鋅離子螯合的最佳條件:溫度30℃,時(shí)間50min,質(zhì)量比2:1。 6.發(fā)芽率是生物檢測(cè)的常用方法,AA-Fe在10-100mg·L-1,對(duì)小麥發(fā)芽率的促進(jìn)和抑制均不明顯,250m

6、g·L-1的發(fā)芽抑制率突然提高。鐵鹽的品種不同對(duì)小麥根長(zhǎng)的抑制程度不同,超過100mg·L-1,三種鐵鹽均抑制伸長(zhǎng)和質(zhì)量,抑制率AA-Fe最高。 7.三種鐵鹽濃度與發(fā)芽指數(shù)(GI)間的曲線模型可分析評(píng)估三種鐵鹽的生物活性,三類鐵鹽模型分別為lnY=ln(99.6378)-0.01627X,Y=97.16-42.2889Lgx+8.588(lgx)2,Y=99.46-40.47lgx(X:鐵鹽濃度,Y:發(fā)芽指數(shù))。 8.小

7、麥種芽對(duì)鐵鹽的影響尤為敏感,最為直觀的反應(yīng)為芽葉與根的生物量和伸長(zhǎng)度的變化。根在形態(tài)與質(zhì)量上響應(yīng)敏感度高于芽。濃度大于100mg·L-1時(shí),三種鐵鹽對(duì)根與芽葉的伸長(zhǎng),鮮重均產(chǎn)生不同程度的抑制,其中以AA-Fe的抑制程度最高,三種鐵鹽根伸長(zhǎng)抑制率AA-Fe>FeSO4>EDTA-Fe。 9.從鐵鹽對(duì)小麥光合系統(tǒng)影響角度分析,AA-Fe的對(duì)小麥的抑制起始濃度在50-100mg·L-1之間,F(xiàn)eSO4與EDTA-Fe對(duì)小麥的抑制起始濃

8、度在100-250mg·L-1之間。三種鐵鹽對(duì)葉綠素的抑制性AA-Fe最強(qiáng),其次為FeSO4,EDTA-Fe最小。 10.芽葉和根MDA濃度應(yīng)鐵鹽品種和濃度的變化而變化,F(xiàn)eSO4與EDTA-Fe處理的芽葉和根中MDA的濃度隨鐵鹽濃度提高先上升,后稍有下降,芽葉MDA變化幅度分別為-41.32%-172%和24.31%-148.96%,根MDA變化幅度分別為75%-571%和90.78%-285.82%;AA-Fe處理的芽葉和根

9、中MDA的濃度隨鐵鹽濃度而提高,變化范圍分別為26.04%-103.82%和21%-652.48%,MDA在根中變化幅度大于芽葉。 11.測(cè)定指標(biāo)對(duì)于鐵鹽濃度的響應(yīng)度上,抑制率指標(biāo)>脂膜過氧化指標(biāo)>葉綠素指標(biāo),生長(zhǎng)指標(biāo)(抑制率指標(biāo))的響應(yīng)度高于生理指標(biāo)(葉綠素指標(biāo)、脂膜過氧化指標(biāo))。FeSO4作用靶位主要為芽,EDTA-Fe與AA-Fe作用靶位主要為根;小麥根脂膜系統(tǒng)對(duì)FeSO4和AA-Fe的響應(yīng)度高,幼芽脂膜系統(tǒng)對(duì)EDTA-F

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