FOC1與FOC4差異基因的比較及乙酰乳酸合酶催化亞基的功能分析.pdf

1、香蕉是世界重要水果之一，也是我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中的重要支柱，主要種植于我國(guó)的南方各省。近年來(lái)，由尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型（Fusarium oxysporumf. sp.Cubense，F(xiàn)OC）引起的香蕉枯萎病對(duì)我國(guó)乃至世界香蕉產(chǎn)業(yè)造成了極大的威脅，但對(duì)于香蕉枯萎病菌致病因子的調(diào)控機(jī)理知之甚少。香蕉枯萎病菌1號(hào)生理小種對(duì)龍牙蕉（AAB）和大蜜哈（AAA）的危害較大，而不侵染矮香蕉（Cavendish，AAA），但4號(hào)生理小種幾乎能侵染所有的香蕉品

2、種，危害極大。鑒于香蕉枯萎病1號(hào)及4號(hào)生理小種的致病能力及寄主范圍的差異，篩選兩個(gè)小種致病及寄主范圍相關(guān)的差異基因，進(jìn)而研究基因功能，為開(kāi)發(fā)新的防治途徑提供理論基礎(chǔ)顯得尤為重要。
　　本研究通過(guò)基因組學(xué)及蛋白組學(xué)的比較，篩選出大量香蕉枯萎病1號(hào)及4號(hào)小種的差異基因、差異蛋白和差異分泌蛋白等，并對(duì)其進(jìn)行了 GO功能注釋和 KEGG信號(hào)通路分析。通過(guò)分析上述結(jié)果，我們從中篩選出9個(gè)處于FOC4重要信號(hào)通路中的特有基因，結(jié)合已報(bào)道的其它

3、病原菌的10個(gè)致病相關(guān)基因進(jìn)行了熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們最終選定一個(gè)疑似引起兩個(gè)生理小種致病差異的基因FOC4_g10000973，根據(jù)該基因在基因組中的注釋以及 NCBI中的比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該基因編碼乙酰乳酸合酶催化亞基蛋白。
　　乙酰乳酸合酶催化亞基基因是一個(gè)長(zhǎng)1086bp的片段，編碼362個(gè)氨基酸，只有一個(gè) ORF，沒(méi)有內(nèi)含子，含有三個(gè)保守的功能域，分別是丙酮酸氧化酶嘧啶結(jié)合區(qū)域、焦磷酸硫氨酸酶的

4、保守區(qū)域、焦磷酸硫胺素酶的超家族結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，該基因在尖孢鐮刀菌的少數(shù)種及不同屬的真菌中相對(duì)保守，且蛋白相似性較高。通過(guò)相關(guān)生物信息學(xué)軟件，發(fā)現(xiàn)該蛋白的α-螺旋、β-折疊，和環(huán)狀結(jié)構(gòu)在整體中分別占的比例是32.60％、14.92%、52.49%，存在螺旋卷曲結(jié)構(gòu)，不穩(wěn)定性較高，且與DNA有13個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，是個(gè)不穩(wěn)定的跨膜蛋白。
　　以乙酰乳酸合酶催化亞基基因本身及其上下游片段設(shè)計(jì)引物，通過(guò)融合 PCR及原生質(zhì)體 PE

5、G轉(zhuǎn)化等技術(shù)獲得該基因的突變體。通過(guò)大量表型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，突變體氣生菌絲量增多，生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量下降顯著，生長(zhǎng)量差異不顯著。另外，突變體對(duì)于剛果紅、熒光增白劑、過(guò)氧化氫的敏感性與野生型相似。轉(zhuǎn)錄分析表明，突變體的乙酰乳酸合酶其他相關(guān)基因的表達(dá)量變化差異不顯著。而酶活實(shí)驗(yàn)中，表明 FOC4野生型的乙酰乳酸合酶活性最高，F(xiàn)OC4突變體的酶活性最低，差異均顯著，且突變體對(duì)于巴西蕉的致病力大幅度下降，發(fā)病時(shí)間大幅度延長(zhǎng)。
　　總之，本研究為進(jìn)