家蠶黑色素合成途徑基因的分子進化.pdf

1、家蠶在大約5000年前由中國野桑蠶馴化而來,長期的人工選擇使家蠶的體色發(fā)生了不同于野桑蠶的顯著變化。迄今為止,家蠶和野桑蠶之間體色差異的分子機制尚不清楚。隨著家蠶基因組框架圖、精細圖和重要遺傳資源重測序的相繼完成,數(shù)以十萬計的EST以及基因全長cDNA序列的陸續(xù)公布,為從分子水平上解析馴化選擇對家蠶特定生物學性狀形成的作用,闡釋家蠶和野桑蠶之間生物學差異的遺傳基礎提供了可能。本研究首先通過對家蠶和野桑蠶體色差異進行比較,并使用透射電鏡分

2、析體壁超微結構的差異;其次,由于昆蟲的黑色素主要通過黑色素合成途徑產生,本研究利用生物信息學分析方法對家蠶基因組中的黑色素合成途徑基因進行鑒定,并分析了各基因的時空表達模式;然后,以家蠶黑色素合成途徑基因為標記,通過克隆測序分析,比較了家蠶和野桑蠶種內核苷酸多態(tài)性和種間分歧度,探索了基因核苷酸多態(tài)性與基因在代謝途徑位置之間的關系;最后,通過中性檢驗、溯祖模擬分析、連鎖不平衡分析、系統(tǒng)發(fā)生分析、單倍型網(wǎng)絡結構分析以及實時定量PCR等,探測

3、家蠶黑色素合成途徑基因是否有人工選擇的印記,并對人工選擇的靶基因進行了鑒定,進而對人工選擇的分子機制進行了推測。主要研究結果如下:
　　 1.家蠶和野桑蠶的體色比較及體壁超微結構分析
　　 無論是幼蟲期、蛹期還是成蟲期,家蠶體色與野桑蠶體色都存在顯著的差異。家蠶幼蟲除了眼狀紋、半月紋及星狀紋區(qū)域為黑色外,表皮的其他區(qū)域呈現(xiàn)出比較均一的白色。而相對于家蠶,野桑蠶五齡幼蟲眼狀紋、半月紋、星狀紋以及尾角區(qū)域為赤褐色,表皮的大部

4、分區(qū)域呈現(xiàn)出黑體色,也有小部分區(qū)域呈淺褐色。家蠶蛹體表為淺黃色,而野桑蠶的表皮呈現(xiàn)顏色較深的棕褐色。家蠶成蟲為白體色,而野桑蠶全身呈現(xiàn)黑褐色,翅有黑色翅斑。
　　 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),家蠶和野桑蠶體壁超微結構主要存在兩個方面的差異:一是真皮層白色尿酸顆粒的數(shù)量不同,野桑查真皮層只有少量的白色尿酸顆粒,而家蠶真皮層含有大量白色尿酸顆粒;二是表皮外層不規(guī)則黑色素顆粒的有無,野桑蠶表皮外層含有大量黑色素顆粒,而家蠶的表皮外層沒有黑色素顆

5、粒的存在。
　　 綜合分析以上結果,可以得出,野桑蠶的體色為較深的黑色或褐色,而家蠶的體色呈現(xiàn)出白色或淺黃色;體壁超微結構分析結果能很好地闡釋了家蠶和野桑蠶體色差異的物質基礎,家蠶之所以呈現(xiàn)白體色,是因為真皮層含有大量白色尿酸顆粒;而野桑蠶的黑體色主要是由表皮外層沉積的大量黑色素導致。由此可見,馴化過程中家蠶體色的改變很可能與黑色素的合成差異相關,而昆蟲中黑色素的合成主要通過黑色素合成途徑來完成。
　　 2.家蠶黑色素合

6、成途徑基因的鑒定和表達模式分析
　　 參照黑腹果蠅黑色素合成途徑9個基因的氨基酸序列,通過同源性比對,我們發(fā)現(xiàn),家蠶基因組中都能搜尋到各自的同源基因,分別位于第1、第4、第8、第11、第13以及第26號染色體,但其中的yellow-f和yellow-f2兩個基因對應了家蠶的同一個預測基因BGIBMGA014224。進一步分析基因結構發(fā)現(xiàn),所有的基因都由多個外顯子構成。
　　 黑色素合成途徑基因在家蠶五齡三天各組織中的表達

7、模式分析發(fā)現(xiàn),酪氨酸羥化酶基因TH主要在家蠶的頭、表皮、脂肪體和氣管中表達;多巴脫羧酶基因Ddc主要在家蠶的頭、表皮、脂肪體、氣管和生殖腺中表達;yellow和yellow-f基因主要在家蠶的頭、表皮、絲腺和氣管中表達;black和ebony基因主要集中在家蠶的頭部表達;Dat1基因集中在家蠶的頭、表皮、絲腺和脂肪體中表達,其次在中腸和氣管中也有微量表達;tan基因在所分析的8個組織中都有表達,其中在脂肪體中表達較低。
　　 利

8、用RT-PCR試驗分析了黑色素合成途徑基因在家蠶不同發(fā)育時期的表達特征,結果表明,TH基因在家蠶幼蟲、蛹及成蟲各個發(fā)育階段都有表達,其中蛻皮期表達量最高;Ddc基因的表達整體水平較低,但表達高峰仍然在蛻皮期;yellow基因表達量最高的時期也分布于一齡眠、二齡眠、三齡眠及四齡眠等蛻皮期;yellow-f基因與TH基因的表達模式相似,蛻皮期表達量最高,蛻皮后的初期表達量開始下降,而盛食期到蛻皮前這段時間基因表達量較低;black基因與ye

9、llow基因相似,在一齡眠、二齡眠、三齡眠及四齡眠等蛻皮期表達量最高,其他時期表達量較低;Dat1基因在幼蟲一齡到四齡的盛食期表達量很低,而從五齡四天到化蛹以及蛾期表達量都較高,同時,蛻皮期表達量也較高;ebony基因的表達主要集中在蛻皮期及蛻皮后的初期,還有就是蛹期和蛾期也有較高的表達水平,其余時期表達很微弱;tan基因在家蠶幼蟲、蛹及成蟲各個發(fā)育階段都有表達,而且時期表達差異不明顯。
　　 綜合分析以上結果,本研究成功鑒定了

10、家蠶黑色素合成途徑基因,并對其時空表達模式進行了分析。組織表達譜分析的結果表明,黑色素合成途徑基因主要在家蠶頭和表皮中高量表達,與家蠶黑色素主要分布于頭和表皮相一致。時期表達譜分析的結果表明,黑色素合成途徑基因表達高峰主要分布在蛻皮期,反映了家蠶黑色素的合成主要發(fā)生在蛻皮期間,同時也說明了黑色素合成途徑基因可能與家蠶表皮的鞣化也緊密相關。這暗示了黑色素合成途徑基因在家蠶馴化過程中并沒有喪失功能。
　　 3.家蠶和野桑蠶黑色素合成

11、途徑基因核苷酸多態(tài)性分析
　　 本研究共測序了8個家蠶黑色素合成途徑基因,每個基因包括30個樣本(15個家蠶樣本和15個野桑蠶樣本)?；谌蛄械募倚Q核苷酸多態(tài)性(πtotal)分析發(fā)現(xiàn),black基因的多態(tài)性最低,πtotal值為0.00031,而tan基因的多態(tài)性最高,πtotal值等于0.02891,家蠶黑色素合成途徑8個基因的核苷酸多態(tài)性平均值為0.01340。相對于家蠶,基于全序列的野桑蠶黑色素合成途徑基因的核苷酸多態(tài)

12、性如下,TH基因的多態(tài)性最低,πtotal值為0.00977,而tan基因的多態(tài)性最高,πtotal值為0.03496,8個基因的核苷酸多態(tài)性平均值為0.02261。利用威爾科克森符號秩檢驗(Wilcoxon signed rank test)進行統(tǒng)計分析結果表明,野桑蠶黑色素合成途徑基因的核苷酸多態(tài)性顯著高于家蠶黑色素合成途徑基因的核苷酸多態(tài)性(P=0.01,df=7),40.7％的野桑蠶核苷酸多態(tài)性在家蠶中發(fā)生了丟失。如果基于群體多

13、態(tài)性參數(shù)θw來進行分析,也可以得到相似的結果:家蠶中black基因的θw值最低(0.00069),tan基因的θw值最高(0.02885),8個黑色素合成途徑基因的平均值為0.01337;而野桑蠶中TH基因的θw值最低(0.01245),tan基因的θw值最高(0.04157),8個黑色素合成途徑基因的平均值為0.02633。利用威爾科克森符號秩檢驗(Wilcoxon signed rank test)進行統(tǒng)計分析結果表明,野桑蠶黑色素

14、合成途徑基因的核苷酸多態(tài)性顯著高于家蠶黑色素合成途徑基因的核苷酸多態(tài)性(P=0.01,df=7),49.2％的野桑蠶核苷酸多態(tài)性在家蠶中發(fā)生了丟失。
　　 黑色素合成途徑8個基因可以分為兩組:TH和black基因編碼黑色素代謝途徑最初的兩個酶,分別將酪氨酸和尿嘧啶加工成黑色素前體,而Ddc、yellow、yellow-f、Dat1、ebony以及tan基因為代謝途徑的下游基因。為了研究基因核苷酸多態(tài)性與基因在代謝途徑位置的關系,

15、我們對核苷酸多態(tài)性的高低是否受基因在代謝途徑位置影響進行了評估。家蠶黑色素合成途徑上游基因TH和black的核苷酸多態(tài)性的平均值為0.00064,而下游基因的核苷酸多態(tài)性的平均值為0.01765。利用t檢驗進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),家蠶黑色素合成途徑上游基因的核苷酸顯著低于下游基因(Student's t-test,P=0.0310,df=6)。野桑蠻群體也有相似的結果:野桑蠶黑色素合成途徑上游基因TH和black的核苷酸多態(tài)性的平均值為0.0

16、1273,而下游基因核苷酸多態(tài)性的平均值為0.02590,利用t檢驗進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),野桑蠶黑色素合成途徑上游基因的核苷酸也顯著低于下游基因(Student's t-test,P=0.0207,df=6)。這表明黑色素合成途徑的位置的確影響了選擇壓力的分布,即上游基因比下游基因受到了更高水平的選擇壓力。
　　 中性檢驗的結果表明,4個家蠶黑色素合成途徑基因(TH、black、ebony以及yellow)和7個野桑蠶黑色素合成途徑

17、基因(TH、black、Ddc、Dat1、tan、yellow以及yellow-f)的Taijma's D值小于0,另外,3個家蠶黑色素合成途徑基因(TH、black以及yellow)和7個野桑蠶黑色素合成途徑基因(TH、black、Ddc、Dat1、tan、yellow以及yellow-f)的Fu and Li's D值小于0,這表明,家蠶和野桑蠶都可能經歷了定向選擇的作用。我們還可以發(fā)現(xiàn),4個家蠶黑色素合成途徑基因(Ddc、Dat1

18、、tan以及yellow-f)和1個野桑蠶黑色素合成途徑基因(ebony)的Taiima's D值大于0,另外,5個家蠶黑色素合成途徑基因(Ddc、Dat1、tan、ebony以及yellow-f)和1個野桑蠶黑色素合成途徑基因(ebony)的Fu and Li's D值大于0,這表明中等頻率的等位基因過量,可能是由于群體的瓶頸效應、群體收縮或者是平衡選擇導致。無論是在家蠶群體,還是野桑蠶群體,所有黑色素合成途徑基因Fay and Wu

19、'sH檢驗都不顯著,這表明各基因都不存在由于搭載效應引起的高頻率的等位基因過量。
　　 家蠶和野桑蠶黑色素合成途徑8個基因的連鎖不平衡分析結果顯示,家蠶和野桑蠶黑色素合成途徑基因的連鎖不平衡曲線在200 bp內呈快速降低趨勢,而在200 bp以上的距離連鎖不平衡曲線降低極為緩慢;野桑蠶黑色素合成途徑基因的r2值在200 bp內快速降低至0.22,并在1600 bp內降低至0.10,而家蠶黑色素合成途徑基因的r2值在200 bp內

20、快速降低至0.54,并始終大于0.40?？傊?家蠶黑色素合成途徑基因的連鎖不平衡程度要高于野桑蠶,表明家蠶由于馴化的影響,黑色素合成途徑基因的重組率低于野桑蠶。
　　 4.家蠶馴化過程中TH基因受到人工選擇的證據(jù)
　　 綜合本研究的結果,我們可以發(fā)現(xiàn),TH基因的確是家蠶馴化過程中人工選擇的靶基因,其主要證據(jù)如下:首先,與野桑蠶相比,家蠶TH基因的核苷酸多態(tài)性降低了90％,序列分析的結果也顯示,在野桑蠶大多數(shù)多態(tài)性位點處,

21、家蠶不呈現(xiàn)多態(tài)性,而且是其中的一種野桑蠶單倍型在家蠶中得到了固定;其次,中性檢驗的結果表明,無論Tajima's D值還是Fu and Li's D值都小于0,統(tǒng)計檢驗也都表明家蠶TH基因顯著偏離中性進化的模型,這意味著TH基因可能受到了定向選擇的作用或者發(fā)生了群體擴張;第三,溯祖模擬的結果也表明,家蠶TH基因顯著偏離瓶頸效應的模型,可能是馴化選擇的靶基因;第四,TH基因的單倍型網(wǎng)絡結構與系統(tǒng)發(fā)生分析結果表明,所有的家蠶樣本能聚類在一起

22、形成一個單獨的cluster,而與野桑蠶樣本明顯地區(qū)分開來;第五,研究結果證明家蠶TH基因的核苷酸多態(tài)性的降低并非由瓶頸效應導致;第六,Fay and Wu's H檢驗以及TH基因連鎖區(qū)域多態(tài)性比較等結果表明,家蠶TH基因并沒有受到搭載效應的影響。因此,人工選擇作用于TH基因,而不是其連鎖區(qū)域。
　　 進一步分析發(fā)現(xiàn),家蠶和野桑蠶TH基因多態(tài)性差異區(qū)段主要位于非編碼區(qū),尤其是內含子區(qū)域,而側翼區(qū)以及CDS區(qū)域,多態(tài)性差異相對較小

23、。共發(fā)現(xiàn)4個種間固定位點,前兩個固定位點位于第一內含子,第三固定位點位于第二內含子,最后一個固定位點位于外顯子上,但密碼子CCA突變成密碼子CCG并沒有造成氨基酸的改變,堿基突變屬于同義替換。轉錄因子識別位點預測結果發(fā)現(xiàn),野桑蠶群體中第一個固定位點存在一個Abd-B及同源HOX蛋白的識別位點(TTTAT),而在家蠶群體中,全部突變成了TTTAA;在第二個固定位點處,野桑蠶群體具有視黃醇類X受體(RXR)異源二聚體結合位點核心序列GGTC

24、,但在家蠶群體中突變成了GGCC而喪失結合能力;但是,在第三個固定位點處,盡管堿基由野桑蠶中的C突變成家蠶中的G,并沒有發(fā)現(xiàn)附近有轉錄因子識別位點的獲得與丟失。迄今為止,尚未有RXR異源二聚體結合位點與昆蟲體色形成相關聯(lián)的研究報道,因此,我們重點關注了第一個固定位點處轉錄因子識別位點的變化。
　　 為了進一步鑒定家蠶馴化過程中TH基因第一內含子Abd-B識別位點是否真正發(fā)生了突變,我們擴大了家蠶和野桑蠶的群體。我們對另外的60個

25、家蠶樣本和7個野桑蠶樣本TH基因第一內含子Abd-B識別位點區(qū)段進行了克隆測序,測序結果表明所有的野桑蠶樣本都含有Abd-B識別位點TTTAT,而所有家蠶樣本中該基序都突變成了TTTAA。
　　 先前的研究表明,Abd-B能通過與識別位點(TTTAT或TTTAC)相結合,增強yellow基因的表達,進而促進雄果蠅第5和第6腹節(jié)黑色素的生成,相反,Abd-B識別位點的突變失活會直接導致雄果蠅第5和第6腹節(jié)黑體色性狀的丟失。因此,本

26、研究通過熒光定量PCR分析家蠶和野桑蠶3個主要發(fā)育時期(幼蟲、蛹及成蟲)TH基因的相對表達量,結果表明,無論是幼蟲、蛹還是成蟲期,家蠶TH基因的相對表達量都要顯著低于野桑蠶(Student's t-test,P<0.0001),這與家蠶相對于野桑蠶呈現(xiàn)的淺體色是完全一致的。而酪氨酸羥化酶(TH)是昆蟲黑色素合成途徑的限速酶,其活性的強弱直接影響昆蟲的體色。
　　 綜上所述,我們推測,TH基因第一內含子中一個可能的增強子元件(Ab