六味地黃通絡(luò)方對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞的增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影響.pdf

1、目的:觀察六味地黃通絡(luò)方對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞的增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影響，以初步探討該方治療白癜風(fēng)的機(jī)制。
　　方法:
　　(1)人含藥血清的制備:選取5名健康志愿者，在服藥前一天空腹采取靜脈血10ml;志愿者連續(xù)服藥3天，每天2次，在末次服藥后1小時(shí)采血靜脈血20ml，制備血清。
　　(2)購入人M14黑色素瘤細(xì)胞，正常培養(yǎng)并完成細(xì)胞傳代操作。
　　(3)MTT法檢測含藥血清對(duì)人M14黑色素瘤細(xì)胞增

2、殖活力的影響:細(xì)胞傳至第三代時(shí)，并呈對(duì)數(shù)生長狀態(tài)時(shí)，將細(xì)胞接種至96孔板，分為A、B、C、D、E5組。在細(xì)胞貼壁后，5組細(xì)胞分別給予人正常血清、5％含藥血清、10％含藥血清、20％含藥血清和陽性對(duì)照藥物干預(yù);繼續(xù)生長72h，MTT法檢測各組細(xì)胞活力。
　　(4)酪氨酸酶活性的檢測:取對(duì)數(shù)生長期的人M14黑色素瘤細(xì)胞接種至96孔板，分組干預(yù)同上，培養(yǎng)72h后，采取L-DO-PA氧化法檢測各組細(xì)胞中酪氨酸酶活性。
　　(5)黑色

3、素含量測定:將人M14黑色素瘤細(xì)胞接種至6孔板中，分組干預(yù)同上，繼續(xù)培養(yǎng)72h后，經(jīng)NaOH裂解法測定各組細(xì)胞中黑色素的含量。
　　(6)半定量PCR檢測各組藥物處理后TYRP-1和MITF的基因表達(dá):各組細(xì)胞處理因素同前，按RT-PCR試劑盒步驟檢測各組細(xì)胞中TYRP-1和MITF的基因的表達(dá)。
　　(7)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)完成分析。
　　結(jié)果:
　　(1)M14細(xì)胞在正常條件培養(yǎng)細(xì)胞生長較

4、好，傳代培養(yǎng)成功。
　　(2)MTT檢測結(jié)果:實(shí)驗(yàn)藥物血清組及陽性對(duì)照組A490值均高于正常血清組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);實(shí)驗(yàn)藥物血清組對(duì)A490值的影響隨著濃度增高而增加。對(duì)M14細(xì)胞的增值率以20％實(shí)驗(yàn)藥物血清組最高，5％實(shí)驗(yàn)藥物血清組最低。
　　(3)對(duì)M14細(xì)胞酪氨酸酶(TYR)活性的影響:正常血清組A490值的均數(shù)值最低，B、C、D、E組與正常血清組均數(shù)相比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);C組與B

5、和D組相比較，均數(shù)值最大，且P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與E組（陽性對(duì)照組）相比較，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;10％含藥血清組對(duì)M14黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性影響最大。
　　(4)對(duì)M14細(xì)胞黑色素含量的影響:NaOH裂解法測得A400值中，各含藥血清組均高于正常血清組，C組與A組間P＜0.05，E組與A組間P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;黑色素含量E組最高，C組次之，C組與E組間P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;即10

6、％含藥血清組促進(jìn)黑色素的合成最為顯著。
　　(5)RT-PCR的結(jié)果:六味地黃湯通絡(luò)方含藥血清能促進(jìn)M14細(xì)胞中TYRP-1和MITF的mRNA表達(dá)，10％含藥血清對(duì)TYRP-1mRNA的表達(dá)作用最顯著，對(duì)MITFmRNA表達(dá)的影響最強(qiáng)的是20％含藥血清組。
　　結(jié)論:
　　(1)六味地黃通絡(luò)方能促進(jìn)M14黑色素瘤細(xì)胞的增殖，其影響與含藥血清濃度呈正相關(guān)。
　　(2)六味地黃通絡(luò)方能增強(qiáng)M14黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶