土壤中煙草根黑腐病菌實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法研究.pdf

1、煙草根黑腐病(Tobacco black root rot disease)是由根串珠霉(Thielaviopsis basicola)引起的嚴(yán)重危害世界煙草生產(chǎn)的真菌病害。T.basicola廣泛分布在世界的主要產(chǎn)煙區(qū)，危害大且難以防治。病殘?bào)w和帶菌土壤是該病的初侵染源。條件適宜時(shí)分生孢子或厚亙孢子萌發(fā)產(chǎn)生侵入絲由傷口侵入寄主表皮細(xì)胞，侵入后菌絲在表皮細(xì)胞間分枝蔓延，形成大量分生孢子和厚垣孢子，進(jìn)行再侵染。由于目前缺乏特效的藥劑和抗性

2、品種，煙草根黑腐病的病后治理難度相當(dāng)大，因此，對(duì)土壤中的煙草根黑腐病菌進(jìn)行定量檢測(cè)，在分生孢子大量滋生以前采取有效措施加以控制對(duì)防治該病害至關(guān)重要。傳統(tǒng)上煙草根黑腐病菌的檢測(cè)方法在一定程度上存在著檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、靈敏度不高的缺點(diǎn)，不能很好的滿足檢測(cè)工作的要求。
　　 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)因其具有快速、特異、靈敏的特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于病原微生物的

3、檢測(cè)。本研究即運(yùn)用PCR技術(shù)，建立了土壤中T.basicola的常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR，以下簡(jiǎn)稱qPCR)檢測(cè)體系。
　　 論文主要研究結(jié)果如下：
　　 ①建立了煙草根黑腐病菌的常規(guī)PCR檢測(cè)體系。在T.basicola的rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物Tb5/Tb6，對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)

4、化，建立了常規(guī)PCR檢測(cè)體系，擴(kuò)增片段為338 bp。該檢測(cè)體系特異性強(qiáng)、靈敏度高，其基因組DNA檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到l pg/μL，土壤中分生孢子檢測(cè)靈敏度為10個(gè)，可用于土壤中T.basicola的檢測(cè)。
　　 ②建立了土壤中煙草根黑腐病菌的SYBR Green(R)ⅠPCR檢測(cè)體系。運(yùn)用上述的特異性引物對(duì)Tb5/Tb6建立了SYBR Green(R)ⅠPCR檢測(cè)體系，以10倍濃度梯度稀釋的T.basicola基因組DNA為模

5、板進(jìn)行擴(kuò)增，其基因組DNA檢測(cè)靈敏度達(dá)100fg/μL。以接種不同濃度病菌分生孢子的土壤DNA為模板進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，土壤中分生孢子檢測(cè)靈敏度為0.4個(gè)，每個(gè)反應(yīng)體系中的分生孢子數(shù)目的對(duì)數(shù)和對(duì)應(yīng)的PCR循環(huán)數(shù)的相關(guān)性系數(shù)為0.95(P＜0.05)。與常規(guī)PCR相比，SYBR Green(R)ⅠPCR對(duì)根黑腐病菌的檢測(cè)靈敏度提高了10倍，對(duì)土壤中分生孢子的檢測(cè)靈敏度提高了25倍。
　　 ③建立了土壤中煙草根黑腐病菌的TaqMan P

6、CR檢測(cè)體系。利用引物探針設(shè)計(jì)軟件Beacon designer設(shè)計(jì)了特異性引物對(duì)TbF/TbR及TaqMan探針TbP，建立了TaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)體系，擴(kuò)增片段為76 bp。以10倍濃度梯度稀釋的T.basicola基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，其基因組DNA檢測(cè)靈敏度達(dá)100fg/μL。以接種不同濃度病菌分生孢子的土壤DNA為模板進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，土壤中分生孢子檢測(cè)靈敏度為0.3個(gè)，每個(gè)反應(yīng)體系中的分生孢子數(shù)目的對(duì)數(shù)和對(duì)應(yīng)